内蒙古农大: 牛奶发酵过程中的代谢差异和单个乳酸乳球菌乳亚种菌株间的发酵速率差异

导读

论文ID

原名：Metabolomics analysis reveals differences in milk metabolism and fermentation rate between individual Lactococcus lactis subsp. lactis strains

译名：代谢组学分析揭示牛奶发酵过程中的代谢差异和单个乳酸乳球菌乳亚种菌株间的发酵速率差异

期刊：Food Research International

IF：7.425

发表时间：2022.9.14

通讯作者：孙志宏

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI号：10.1016/j.foodres.2022.111920

实验设计

将全脂奶粉(11.5%)悬浮在蒸馏水(82%)中，溶解后加入蔗糖，经过均质、巴氏灭菌、冷却之后将牛奶分装到无菌烧杯中。将测试的17株乳酸乳球菌乳亚种(活细胞数为5×10⁶CFU/mL)接种到牛奶中，在37℃下培养至pH值达到4.60，然后停止发酵(每个样品有三个重复)。在接种后和发酵后使用M17琼脂平板浇注法立即测定发酵乳中的活菌数，以确保活细胞数达到5×10⁶ CFU/mL。发酵的牛奶被分装并储存在-80℃环境中。使用时将样品解冻、离心之后取上清液加入乙腈，静置离心之后旋转蒸发浓缩9 h，再加乙腈溶液，用0.22-μm的微孔膜进行过滤，将滤液收集在样品瓶中。同时，每6个样品采集一次质控样品。预处理后的酸奶样品通过UPLC-Q-TOF MS^E进行分析，并采用反向UPLC系统在液相中进行梯度洗脱。使用MassLynx4.1工作站采集UPLC-Q-TOF MS^E获得的原始数据，并使用Progenesis QI进行处理，获得所有代谢物的定量数据。通过监督偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，筛选出差异代谢物。根据差异代谢物的质荷比、保留时间和片段信息，检索Chemspider、人类代谢组数据库(HMDB)、METLIN、KEGG数据库，获得参考代谢物并完成鉴定。

前言

超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱高能分析法(UPLC-Q-TOF MS^E)是代谢分析中常用的分析平台。该平台具有高质量、高精度、高分辨的特点，可以准确地对代谢物进行定量和定性分析，因此成为非靶向代谢物测定的首选。为了深入探讨不同乳酸乳球菌乳亚种生产的发酵乳的发酵特性，本研究对17种不同的发酵乳进行了代谢组学研究。通过使用UPLC-Q-TOF MS^E对发酵乳中的代谢物进行鉴定，发现各个乳酸乳球菌乳亚种菌株的代谢特征(即发酵速率)随其固有的代谢能力而变化。这项研究为一种常用发酵剂产酸率的控制因素提供了新的认识，并为筛选潜在的工业菌株提供了方法。

结果

1 、单个乳酸乳球菌乳亚种菌株发酵时间的差异

为了确定发酵乳中的活菌数，在接种和发酵后分别记录发酵乳的菌落总数，并监测每个发酵乳整个发酵过程的时间(表1)。结果显示，发酵乳中乳酸乳球菌乳亚种的初始浓度为10⁶ CFU/mL，当发酵达到终点时(pH=4.6)，浓度达到10⁹ CFU/mL。以往研究表明，这17个乳酸乳球菌乳亚种可以产酸，所以在发酵过程中，随着菌株的生长pH值逐渐下降，这意味着每个菌株的发酵要求与其产酸能力有关。然后根据发酵时间将发酵乳分为两组：快速组(发酵时间<16h)和慢速组(发酵时间≥16h)，随后的分析都是基于这种分组进行的。

2、 PLS-DA和差异代谢物分析

用UPLC-Q-TOF MS^E平台来比较不同的乳酸乳球菌乳亚种发酵乳的代谢谱。为了比较发酵乳的代谢水平差异，采用PLS-DA对发酵乳中的代谢物进行监督分析(图2A)，并用R²Y(适配性)和Q²(预测性参数)来验证PLS-DA模型的准确性和预测性(图2B)。R²Y和Q²都大于0.7，表明PLS-DA模型具有良好的准确性和可预测性。此外，每个平行样本都有聚类，在快速组和慢速组之间观察到明显的分离趋势。PLS-DA分析中的质控样品也被聚在一起，反映了仪器良好的稳定性和可重复性。因此，在发酵结束时，快速组和慢速组发酵乳样品的代谢特征具有明显的差异。计算两组代谢物的P值和差异倍数值，并以P＜0.05、差异倍数＞2和P＜0.05、差异倍数＜0.5为阈值绘制火山图(图2C)，以此确定两组的差异代谢物。离原点越远，这个变量的贡献越大，而差异越大越有可能是一个潜在的标志物。最终，初步确定了153个差异代谢物。在快速组中，分别确定了98个增加(红点)和55个减少(绿点)的代谢物(表S2)。

图2 发酵结束时快速发酵组和慢速发酵组之间的代谢组学差异。(A)用偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)分析发酵结束时快速和慢速发酵组之间的代谢物数据。(B)PLS-DA模型的验证指标，R²Y和Q²。(C)火山图说明了发酵后快速和慢速发酵组的代谢物。(原文图1）

3 、差异代谢物功能通路分析

功能通路分析可以将代谢物的变化与特定的代谢途径联系起来。圆圈的颜色代表富集的程度，显著性从红色(最显著)到黄色(最不显著)进行收缩。横轴代表影响值富集因子，纵轴代表P值的大小。在本研究中，功能通路分析显示，153个代谢物主要富集在7个代谢途径中(图3)，即脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、苯丙氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，肌醇磷酸酯代谢、二甲苯降解，以及氨酰-tRNA生物合成途径。虽然在苯丙氨酸代谢途径中只涉及一种差异代谢物，但两组之间存在显著差异(P=0.03)。

图3 快速发酵组和慢速发酵组之间差异代谢物的富集途径。圆圈的大小表示有多少代谢物被富集，圆圈越大，富集的代谢物就越多。圆圈的颜色代表富集的显著性，红色越深，该途径的富集越显著，横轴代表富集因子，纵轴代表P值的大小。(关于本图例中对颜色的解释，请参考本文的网络版)。(原文图2)

4 、差异代谢物的鉴定和分析

为了鉴定差异代谢物，利用MSE数据采集方法获得母离子和相应的片段信息。根据保留时间和质荷比，通过Progenesis QI软件筛选，共鉴定出37种代谢物，包括6种酯类、26种肽类、1种酰胺类和4种其他代谢物。分析各发酵乳中差异代谢物的含量发现，快速组脂类和肽类的含量高于慢速组(图4A)。为了全面研究单株乳酸乳球菌乳亚种发酵乳代谢物的变化，以及不同样品之间的关系和代谢物数量的差异，对代谢谱进行了比较分析，并构建热图来比较和识别不同发酵乳中差异代谢物的分布(图4B)。在快速组和慢速组之间确定的差异代谢物的丰度是明显不同的。肽类和酯类是快速组和慢速组之间的主要差异代谢物。快速发酵组的牛奶含有许多肽，如ser-trp、phe-ile、asp-arg-his、leu-phe-leu和ile-ile-phe-tyr，以及各种酯，如棕榈酸乙酯、乳酸乙酯和三丁酸甘油酯。这些酯类使发酵乳具有独特的风味，并提高最终产品的质量。快速组的四肽含量高于慢速组(图4C)。分析不同代谢途径的代谢物的丰度发现，快速组含有较高的苯丙氨酸和色氨酸。在快速组出现的肽中，重要的氨基酸是脯氨酸、精氨酸和苯丙氨酸(图4D)，苯丙氨酸也是快速组和慢速组差异代谢物富集途径中的主要物质。

图4 快速组和慢速组单一菌株发酵乳中差异代谢物的富集图。(A)不同的乳酸乳球菌乳亚种单一菌株发酵乳中鉴别出的差异代谢物的分布。(B)氨基酸出现的频率。(C)瀑布图显示肽类代谢物的比例。(原文图3)

5 发酵时间和差异代谢物的网络图分析

发酵乳发酵速率的不同是由许多因素造成的，如菌株的产酸能力和接种剂量。因此，在本研究中通过控制接种剂量研究了发酵乳中的差异代谢物。在差异代谢物之间观察到强烈的相关性(R>0.68，R<-0.68；P<0.05)，表明发酵乳的代谢物可以相互影响。大多数强相关关系是在多肽之间观察到的，一些多肽也与三丁酸甘油酯表现出强相关关系(图5)。三丁酸甘油酯、thr-arg-gly-his、asp-thr-thr-lys和leu-val-leu与发酵时间明显负相关(P<0.001，R=-0.8192；P<0.001，R=-0.7097；P<0.001，R=-0.6900；P<0.001，R=-0.6827；表S3)。而大多数肽类和酯类在快速组中富集，这进一步表明，酯类和肽类可能调节发酵时间。因此，不同代谢物的变化改变了不同发酵剂的发酵环境，直接或间接地影响发酵时间。

图5 网络图显示了发酵时间和差异代谢物之间的Spearman相关性。圆圈的大小表示丰度的大小，圆圈越大，丰度越大。红色代表发酵时间，黄色代表三丁酸甘油酯，橙色代表二肽，紫色代表三肽，绿色代表四肽。发酵时间和差异代谢物之间的重要关联由弧形线连接，线的颜色表示相关的强度，与颜色方案保持一致。颜色代表1和-1之间的Spearman相关系数数值大于0表示正相关，反之亦然。(原文图4)。

6 、代谢物的多变量接受者操作特性(ROC)分析

ROC曲线是评估一个或多个生物标志物预测性能的图形工具，表示一个生物标志物区分两组的能力。使用随机森林算法来计算影响率，绘制该物质和曲线下面积(AUC)的折线图(图6A)。AUC值越接近于1，预测结果越好。在本研究中，83个代谢物的AUC有很高的影响率，超过1.00，排在84名的代谢物的影响因子为0.968(图6B，表S4)。根据差异倍数和P值，将机器筛选的前83个代谢物与联合筛选的代谢物进行比较。在两组结果之间的重叠部分出现了14种差异代谢物(图6C，表S5)，标红的是那些根据P值和差异倍数值筛选的差异代谢物与用机器筛选的代谢物的重叠部分。所鉴定的差异代谢物具有良好的代表性，这可能为在快速组和慢速组之间快速分类菌株提供了一种新的方法。这14种代谢物包括11种肽类和3种酯类，进一步表明肽类和酯类的含量与发酵速率有关。

图6 代谢物的接受者操作特性(ROC)分布在快速组和慢速组之间存在显著差异。(A)代谢物数量和相应的ROC图。(B)ROC曲线。(C)机器模型筛选出的差异代谢物，红色字体表示与P值和差异倍数值筛选出的差异代谢物重叠的代谢物。(原文图5)。

讨论

结论