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内蒙古农大: 格氏乳杆菌G098可缓解DSS引起的小鼠炎症性肠病症状(国人佳作)

时间:2022-09-23 来源:微生态 作者:微科盟九卿臣 浏览次数:659

导读


炎症性肠病(IBD)是一种反复发作的胃肠道炎症性疾病,病因尚不明确,但通常被认为与免疫异常和肠道微生物失调等因素有关。而益生菌可以调节宿主免疫和肠道菌群;因此,我们研究了格氏乳杆菌G098(G098)对硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎的缓解作用及机制。试验将小鼠分为三组(每组8只):正常对照组(NC),DSS诱导的结肠炎小鼠(DSS),以及给予菌株(G098)的结肠炎小鼠。结果显示,G098给药有效缓解了DSS诱导的结肠炎相关症状(减轻小鼠体重下降,降低疾病活动指数和病理评分;所有情况下的P<0.05),并防止了由于DSS诱导而引起的死亡的发生(DSS组存活率为62.5%;G098组存活率为100%)。同时,G098组的死亡率和炎症症状的改善伴随着更加健康的血清细胞因子平衡。相比DSS组,G098组的血清促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α显著下降,血清抗炎因子IL-13显著增加(P<0.05),肠道微生物组的多样性更高,Firmicutes和Lachnoclostridium明显增多,Bacteroidetes明显减少(P<0.05),以及糖降解相关途径的基因丰度明显更高(P<0.05)。综上所述,G098的摄入可以通过调节宿主免疫和肠道菌群来缓解DSS诱导的结肠炎,菌株治疗是一种有前景的IBD管理策略。


论文ID


名:The Lactobacillus gasseri G098 strain mitigates symptoms of DSS-induced inflammatory bowel disease in mice

格氏乳杆菌G098可缓解DSS引起的小鼠炎症性肠病症状

期刊Nutrients

IF:6.706

发表时间:2022.9.10

通讯作者:陈永福

通讯作者单位:内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI号:10.3390/nu14183745


实验设计


经过1周的适应性训练,小鼠被随机分为三组(每组8只):NC组、DSS组和G098组。从第0天到第7天,NC组的小鼠自由饮用蒸馏水,而其他组在饮用水中添加DSS(2.5%,w/w)以诱导小鼠发生IBD。从第8天到第17天,NC组和DSS组接受0.9%生理盐水(0.2 mL/d)灌胃,而G098组接受G098乳杆菌(重悬于0.9%生理盐水中,4×109CFU/0.2 mL/d)灌胃。在整个实验过程中,每天观察并记录小鼠的体重、健康状态(腹泻、便血、活动)和死亡情况。在第18天,收集新鲜粪便并储存在-80℃条件下,用十二烷基硫酸钠法提取粪便DNA,用Qubit® 2.0荧光仪进行定量分析,并在Illumina NovaSeq PE150平台上进行DNA测序,由Agilent 2100 Bioanalyzer进行大小分布分析,并使用实时PCR进行定量,最后使用HUMAnN2进行分类学注释。同时通过挥发性异氟醚给药处死小鼠,清除结肠内容物,测量结肠长度和重量。之后,将结肠分为两部分:将远端结肠固定在4%多聚甲醛溶液中,经脱水、染色等操作后利用显微镜进行图像采集,然后通过CaseViewer软件对采集的图像进行组织学评估;其余部分在-80℃下冷冻。收集小鼠血液,通过离心(3000× rpm,4℃,10 min)获得血清,血清样品保存在-80℃,后续用ProcartaPlexTM对几种血清炎症细胞因子水平进行定量。


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图1 实验设计图

前言


炎症性肠病(IBD)是一种发生在回肠、直肠和结肠的慢性、非特异性免疫介导的、复发性胃肠道疾病。在过去的250年中,IBD的发病率呈爆炸性增长。肠道菌群对人类健康具有关键作用,它为宿主提供营养和能量,帮助宿主抵御病原体,并调节肠道免疫系统。与健康个体相比,IBD患者的肠道菌群多样性和丰富度较低,宿主肠道菌群的失调状态也将破坏肠道免疫系统的平衡,激活异常的免疫反应。目前,主流的IBD治疗药物包括传统药物、生物制剂和小分子生物制剂等,这些药物主要作用在于缓解炎症。然而,患者对这些药物治疗的反应是有限的,且有许多非常昂贵,并且有严重的副作用,所以迫切需要找到治疗IBD的新策略。因此,微生物制剂和干细胞移植等新的治疗方法引起了人们的关注,寻找更安全、更有效治疗方法已成为IBD管理的研究热点之一。

益生菌是定植于人体并赋予宿主健康益处的活微生物。以往研究表明,益生菌可以通过恢复更平衡的肠道菌群,调节宿主免疫力,增强肠道粘膜功能等途径来缓解IBD的症状。格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)已被证明可以维持肠道健康和调节宿主免疫力。然而,关于格氏乳杆菌缓解溃疡性结肠炎的研究报道很少。格氏乳杆菌G098是以前从中国西藏自治区拉萨市一个健康婴儿的肠道中分离出来的菌株,该菌株对人工胃肠液和胆汁盐表现出良好的耐受性,是一株潜在的益生菌株。本研究旨在研究格氏乳杆菌G098能否以及如何改善肠道生态系统并缓解DSS诱导的IBD模型小鼠结肠炎的相关症状,重点是调控炎症细胞因子水平和肠道菌群的组成和多样性。


       结果


格氏乳杆菌G098减轻了结肠炎小鼠的炎症表现


在动物试验中,NC组和G098组的所有小鼠全部存活,但DSS组的三只小鼠分别在第8、10和14天死亡,最终存活率为62.5%(图2A)。在第1至7天,DSS组和G098组的DAI评分(根据体重减轻、腹泻和血便计算)显示出上升趋势,但NC组没有。在第7天,DSS组和G098组的DAI评分明显高于NC组(P<0.0001),而DSS和G098组之间没有明显差异(图2B),证实DSS处理导致DSS和G098组小鼠出现结肠炎。与DSS组相比,10天的菌株干预显著降低了G098组小鼠的DAI评分(P<0.05;图2C)和体重减轻(P<0.05;图2D)。此外,与DSS组相比,G098组小鼠的结肠长度/重量比增加(P>0.05;图2E)。

DSS组的结肠组织病理学评分明显高于NC组(P<0.05,图2F),而G098的组织学评分明显低于DSS组(P<0.05,图2F)。NC组、DSS组和G098组结肠组织的典型显微照片见图2G。NC组小鼠结肠的粘膜、粘膜下层、肌肉和质膜层都很完整,没有明显的病理变化。此外,肠道腺体发育良好,杯状细胞丰富,没有明显的炎症细胞浸润。G098组小鼠的肠道粘膜层表现出类似的组织学特征,只有少量的炎症细胞浸润,但局部肠腺结构没有明显变化。相反,DSS组的小鼠结肠粘膜局部上皮细胞脱落,肠腺结构不明显,杯状细胞减少,粘膜固有层有明显的炎症细胞浸润。这些结果表明,G098的干预可以明显防止DSS处理引起的结肠粘膜和局部肠腺结构的病理损伤。


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图2 正常对照组(NC)、硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导组和格氏乳杆菌G098(G098)组之间炎症表现的差异。(A)各组存活率。(B)疾病活动指数的变化。(C)第17天相对于基线的疾病活动指数的变化。(D)第17天相对于基线的体重变化。(E)结肠长度/重量比。(F)组织学评分。(G)结肠组织的苏木精和伊红染色显微图像(40×和150×放大),显微图像(150×放大)是红色箭头所示区域的放大图像。误差线代表平均值的标准偏差。统计分析采用Tukey多重比较检验(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001)。


摄入格氏乳杆菌G098可逆转DSS引起的血清促/抗炎细胞因子水平的变化


在第18天测量了血清中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α(图3A-3C)以及抗炎因子IL-10和IL-13(图3D、3E)的水平。DSS组的三种促炎细胞因子水平都明显高于NC组,但在G098组明显较低(IL-1β:NC组0.71±0.63 pg/mL,DSS组10.85±7.26 pg/mL,G098组1.06±0.76 pg/mL,DSS vs NC,P<0.01,DSS vs G098,P<0.01;IL-6:NC组0.45±0.49 pg/mL,DSS组56.09±48.36 pg/mL,8.57±9.26 pg/mL,DSS vs NC,P<0.01,DSS vs G098,P<0.05;TNF-α:NC组2.56±0.51 pg/mL,DSS组6.50±2.28 pg/mL,G098组3.22±1.09pg/mL,DSS vs NC,P<0.001,DSS vs G098,P<0.001;图3A-3C)。NC组的IL-13和IL-10水平分别为1.84±1.43 pg/mL和9.75±8.02 pg/mL,DSS组IL-13水平明显(0.30±0.25 pg/mL,P<0.05;图3E)降低,而IL-10水平(3.81±2.99 pg/mL,P>0.05;图3D)降低不显著。菌株干预使IL-13水平显著增加(G098为1.61±0.88 pg/mL,P<0.01;图3E),而IL-10水平(G098为7.32±3.09 pg/mL,P>0.05;图3D)增加不显著。

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图3 正常对照组(NC)、硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导组和格氏乳杆菌G098(G098)组的血清细胞因子水平的差异。(A)白细胞介素(IL)-6;(B)IL-1β;(C)肿瘤坏死因子(TNF)-α;(D)IL-10;和(E)IL-13的水平。误差线代表平均值的标准偏差。用Tukey多重比较检验评估组间差异(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001)。


格氏乳杆菌G098对肠道菌群组成的影响


Simpson指数和Shannon指数是衡量微生物多样性的指标。与NC组相比,DSS组小鼠的Simpson和Shannon指数值明显降低(分别为P<0.05和P<0.05),G098给药缓解了DSS引起的肠道微生物多样性的减少(两种情况下均为P<0.05;图4A、4B)。然后,通过主坐标分析(PCoA;Bray-Curtis距离;图4C)对小鼠肠道菌群的β-多样性进行分析。在PCoA图中,代表NC组的符号聚集在一起,而代表DSS和G098组的大多数符号在图中的位置很接近。t检验证实,正常小鼠和DSS处理的小鼠肠道菌群结构在有/无菌株处理时存在明显差异(NC vs DSS,R2=0.3955,P=0.005;NC vs G098,R2=0.2033,P=0.002)。然而,G098处理可以在一定程度上减少这种差异(R2=0.1534,P=0.117),尽管G098组和DSS组之间有部分重叠(图4C)。

此外,比较了各组之间的肠道微生物图谱。整个粪便微生物群由四个主要门组成,包括Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria和Verrucomicrobia(图4D)。与NC组相比,DSS组有明显更多的Bacteroidetes和Verrucomicrobia(分别为P<0.05和P<0.01;图4E)以及明显更少的Firmicutes和Proteobacteria(分别为P<0.05和P<0.01;图4E)。相反,与DSS组相比,G098组有更多的Firmicutes(P<0.05;图4E),更少的Bacteroidetes(P<0.05;图4E)。在属水平上(图4F),检测到的前三个属是Muribaculaceae(16.9%至32.5%),Lachnospiraceae(5.5%至15.7%)和Bacteroides(5.1%至18.3%)。为了进一步分析菌株对DSS诱导的IBD小鼠肠道菌群的影响,我们分析了G098干预后表现出显著变化的细菌属。与DSS组相比,在G098组发现了明显的DesulfovibrioLachnoclostridium(分别为P<0.05和P<0.05;图4G、4H),而Muribaculaceae(P<0.05;图4I)没有明显差别。

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图4 正常对照组(NC)、硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导组和格氏乳杆菌G098(G098)组的肠道菌群分类。(A) Shannon指数。(B) Simpson指数。(C) 小鼠肠道菌群的主坐标分析(PCoA;Bray-curtis距离)得分图。(D) 门水平肠道菌群分布。(E)Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria和Verrucomicrobia的相对丰度。(F) 属水平肠道菌群分布。(G-I)小提琴图显示了DesulfovibrioLachnoclostridiumMuribaculaceae的相对丰度。误差线代表平均值的标准偏差。采用Tukey多重比较检验进行统计分析(*P<0.05;**P<0.01)。


格氏乳杆菌G098对肠道菌群代谢途径的影响


火山图显示了在肠道菌群中检测到的代谢途径的P值(t检验)和倍数变化(FC)(共228条代谢途径;图5A)。与DSS组相比,G098组检测到5条明显增加的代谢途径,包括D-半乳糖降解V(Leloir途径)、半乳糖降解I(Leloir途径)、水苏糖降解、CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonate生物合成I和L-谷氨酸降解V(通过羟基戊二酸)(P<0.05和FC≥2或≤0.5;图5A)。

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图5 差异类群、代谢途径和相关性分析。(A)火山图显示葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导组和格氏乳杆菌G098(G098)组的肠道菌群之间的差异代谢途径(临界值:P<0.05和FC≥2或≤0.5),每个点代表一个检测到的途径,差异代谢途径以红色显示并有注释。(B)Spearman相关热图显示了差异类群、代谢途径、血清细胞因子水平和疾病活动指数之间的关联。*和**分别代表P<0.05和P<0.01,色标代表r值。


显著差异肠道菌群与肠道代谢途径、血清细胞因子和DAI之间的相关性


然后,对肠道菌群、细胞因子和DAI编码的差异代谢通路与显著变化的属水平细菌进行相关性分析。确定了几个重要的关联(图5B)。Muribaculaceae与D-半乳糖降解V(Leloir途径;P<0.01,R=-0.56)、半乳糖降解I(Leloir途径;P<0.01,R=-0.56)和水苏糖降解(P<0.01,R=-0.58)呈显著负相关。相反,DesulfovibrioLachnoclostridium与D-半乳糖降解V(Leloir途径;分别为P<0.05,R=0.51;P<0.01,R=0.72)、半乳糖降解I(Leloir途径;分别为P<0.05,R=0.51;P<0.01,R=0.72)和水苏糖降解(分别为P<0.05,R=0.54;P<0.01,R=0.70)呈显著正相关。此外,Lachnoclostridium还与L-谷氨酸降解V途径(通过羟基谷氨酸)(P<0.01,R=0.76)和细胞因子IL-13(P<0.01,R=0.60)呈正相关。


讨论


本研究分析了在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中施用格氏乳杆菌G098对IBD临床表现的有益影响。研究结果显示格氏乳杆菌G098能有效缓解结肠炎相关症状,并伴随着小鼠肠道菌群和代谢途径的一些变化。


本研究通过连续7天在饮水中给予2.5%的DSS(W/V),成功诱导小鼠结肠炎,模拟了IBD症状。DSS组的小鼠体重下降,且肉眼可见小鼠粪便松散带血。在第7天,DSS组的DAI评分明显高于NC组(图2B)。用G098干预10天后,DAI评分明显下降,扭转了体重下降的趋势,并减轻了DSS引起的结肠炎症状(图2C-E)。通过HE染色对小鼠结肠病理进行了观察和评分,发现G098可以明显缓解DSS诱导的结肠组织中的肠腺损伤,同时大大降低了炎症细胞的浸润程度,病理评分与DSS组相比也明显降低(图2F-G)。这些结果均表明G098能有效缓解IBD相关的症状。重要的是,在整个实验过程中,G098组小鼠没有死亡(而DSS组的存活率为62.5%;图2A),进一步证实了G098的摄入对DSS诱导的疾病的保护作用。


有研究认为,不同细胞因子的水平和功能与IBD的严重程度密切相关,通过调控细胞因子的分泌可以缓解肠道炎症。IL-1β和IL-6是两种关键的促炎细胞因子,参与了多种自身免疫性炎症反应和细胞活动。另一方面,TNF-α在IBD的发病机制中同样起着重要作用,它能诱导结肠上皮细胞大量凋亡,参与固有层的炎症反应和上皮细胞脱落,增加肠道屏障细胞的通透性,从而加重炎症反应。此次研究发现,在DSS处理的小鼠中,G098的给药具有普遍的抗炎作用,表现为促炎症和抗炎症细胞因子水平的降低和增加(图3),这可能是保护小鼠免受结肠炎的重要机制。


众多研究表明,结肠炎的发生和缓解与肠道菌群密切相关,IBD患者的肠道菌群多样性降低,微生物群结构和组成发生改变,Escherichia coli等有害细菌水平升高,Firmicutes和Alistipes等有益细菌丰度降低。微生物宏基因组分析发现DSS与NC小鼠之间以及DSS与G098小鼠之间存在不同的细菌家族(图4D-F)。然而,在DSS干预后,Akkermansia muciniphila相对丰度的变化趋势与以往的研究不同。这种差异可能与动物模型、是否与其他致病菌共存以及宿主性别等因素有关,值得进一步研究。


本研究发现,G098的摄入可以显著提高DSS组肠道菌群的α-多样性(图4A、4B),缩小DSS组和NC组小鼠之间肠道菌群结构组成的差异(图4C)。G098处理也明显提高了肠道Firmicutes的相对丰度,同时降低了肠道Bacteroidetes的比例(图4D-E)。G098给药后Firmicutes/Bacteroidetes比例的增加表明该菌株可以有效逆转DSS引起的微生物群失调。在属水平上,G098组Lachnoclostridium的相对丰度明显高于DSS组(图4H)。SCFAs与肠道炎症密切相关,它们参与了抗炎信号的多种代谢途径。此外,本研究发现Lachnoclostridium与抗炎因子IL-13之间存在显著正相关关系(图5B),表明G098给药对调节宿主肠道免疫反应具有潜在作用。另一方面,以往的研究发现,DSS组的Desulfovibrio比益生菌干预组更丰富,与当前G098组Desulfovibrio比例较低的结果相反(图4G)。Desulfovibrio能在肠道内产生硫化氢(H2S),对肠道上皮细胞有毒性,引起胃肠道疾病。然而,已经发现H2S可以直接促进血管生成,因此有利于胃肠道溃疡的愈合,这可能是由于溃疡边缘的粘膜血流增强,促进溃疡修复。


最后,采用HUMAnN2来识别肠道微生物组编码的潜在功能途径,结果显示共有228条通路。与DSS组相比,G098组编码的基因丰度较高,包括糖降解相关途径(如水苏糖降解、D-半乳糖降解V(Leloir途径)和半乳糖降解I(Leloir途径),以及L-谷氨酸降解V(通过羟基戊二酸);图5A)。谷氨酸是产生乙酸盐和丁酸盐等SCFAs的主要原料,肠道SCFAs在肠道上皮细胞的能量供应、电解质平衡、维护肠道粘膜屏障、调节免疫和抗肿瘤作用方面发挥着重要的生理作用。L-谷氨酸降解V(通过羟基戊二酸)的代谢途径与Lachnoclostridium呈显著正相关,Lachnoclostridium是一个已知产生SCFAs的细菌属。因此,G098可能刺激编码上述途径的部分肠道菌群生长,并调节部分生理功能,包括SCFA的产生和加强肠道粘膜屏障,缓解肠道炎症。


综上所述,格氏乳杆菌G098治疗可以缓解DSS诱导的小鼠炎症性肠病的症状。未来,需要进一步探索格氏乳杆菌G098缓解结肠炎的具体机制,并继续开展相关的纵向研究,为应用格氏乳杆菌G098治疗和防治IBDs提供更多证据。


结论


本研究表明,格氏乳杆菌G098可以通过减少结肠组织的粘膜损伤、调节免疫反应、恢复肠道菌群多样性和增加肠道菌群稳定性等途径来缓解DSS引起的小鼠结肠炎。未来应进一步评估格氏乳杆菌G098对IBD的临床疗效,以及格氏乳杆菌G098缓解实验性结肠炎的具体机制。


原文链接:https://www.mdpi.com/2072-6643/14/18/3745



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