内蒙古农大孙天松教授团队揭示鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9可延长秀丽隐杆线虫的寿命(国人佳作)

导读

益生菌被认为有助于维持宿主肠道菌群的平衡并对健康产生影响，但很少有研究关注它们在延缓宿主衰老方面的潜力。本研究发现健康母乳益生菌鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9(Lacticaseibacillus rhamnosus Probio-M9)可增强模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的运动能力，减缓其肌肉功能衰退。活菌状态的Probio-M9以不依赖饮食限制的方式显著延长线虫寿命。通过筛选各种与衰老相关的线虫突变体，发现Probio-M9通过p38级联反应和daf-2信号通路延长寿命，不依赖daf-16，但依赖于skn-1。Probio-M9通过激活线粒体未折叠蛋白反应来保护和修复受损的线粒体。细菌代谢产物中氨基酸、鞘磷脂、半乳糖和脂肪酸的显著增加可能与线虫寿命的延长有关。本研究揭示了Probio-M9作为一种膳食补充剂具有延缓线虫衰老的潜力，也为进一步分析益生菌在改善宿主健康和延缓衰老相关慢性疾病发生方面提供了新的方法和见解。

论文ID

原名：Lacticaseibacillus rhamnosus Probio-M9 Extends the Lifespan of  Caenorhabditis elegans

译名：鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9延长秀丽隐杆线虫寿命

期刊：Communications Biology

IF：6.548

发表时间：2022.10.27

通讯作者：孙天松

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

本实验在20℃下的线虫生长培养基(NGM)琼脂平板上进行线虫培养，Probio-M9和LGG在37℃的MRS肉汤中厌氧培养24 h，连续培养三代作为实验菌液。E. coli OP50在37℃ Luria-Bertani(LB)肉汤中摇床孵育12 h。之后制备菌板：对照组：E. coli OP50，实验组：Probio-M9悬浮于E. coli OP50，取40 μL涂布于60 mm培养皿。使用L4后期的线虫作为t = 0进行寿命测定。虫卵在OP50或OP50+Probio-M9上培养至L4后期后进行细菌选择实验。将20个卵放置在20个培养皿上，作为t = 0进行生命周期分析；将20条L4后期的同步化雌雄同体虫每天转移到新鲜培养皿中评估其后代数目；从成虫的第1-5天随机挑取20条进行体型分析。从成年后第2-14天选择不同年龄段线虫进行吞咽频率测定。从成年后的8-16天选择不同年龄段线虫测量其运动能力。第10天或第15天用M9缓冲液冲洗3次，麻醉后在激光扫描显微镜下获得荧光图像后进行脂褐质积累实验。第5天在34℃下暴露，分别于12 h、18 h和24 h后测定其存活率，评估其耐热性。线虫放入M9缓冲液中，研磨后用M9缓冲液连续稀释线虫裂解液，MRS培养基培养后进行肠道细菌CFU的测定。线虫麻醉染色后在激光扫描显微镜下获得荧光图像后评估线粒体膜电位的影响。利用超高效液相色谱-质谱进行代谢组学分析，以确定OP50和Probio-M9之间的差异调节代谢物。

图1 实验设计图

结果

接下来，评估了Probio-M9对线虫寿命影响。同步化L4后期线虫从OP50转移到OP50+Probio-M9或继续在OP50上培养，每天测定存活率，直到所有线虫死亡。结果表明，OP50+Probio-M9显著延长线虫寿命约30% (图2a和补充表1)。当Probio-M9在细菌混合物中的比例发生变化(稀释或增加)时，仍然可以观察到寿命延长(图2b和补充表1)，但以OP50:Probio-M9 (OP50+Probio-M9)1:4的比例为最佳，说明Probio-M9的有益作用是剂量依赖性的。

图2 喂食Probio-M9对线虫寿命调节的影响。a Probio-M9显著延长野生型N2线虫寿命(p<0.0001)。b 最佳剂量Probio-M9 (OP50+4 Probio-M9)可显著延长野生型N2线虫寿命(p<0.0001)。较低(OP50+0.04 Probio-M9和OP50+0.4 Probio-M9)或较高(OP50+40 Probio-M9)的Probio-M9对寿命延长影响较小(p<0.05)。在a和b中，三次独立重复实验，并在单个实验中测试了90条OP50或OP50+Probio-M9喂养的线虫。OP50和Probio-M9用量分别为6.8×10⁸CFU/mL和2.82×10⁹CFU/mL。(原文图1)

2、Probio-M9对线虫具有促进健康的作用

由于寿命和抗应激性是相互关联的，研究了Probio-M9对线虫抗物理(温度)应激的影响。在成年第5天，喂食OP50+Probio-M9的线虫在暴露于34℃高温下18或24 h后，存活率显著高于喂食OP50的线虫(图3k)。这表明，Probio-M9对线虫的热稳定性有积极影响。总之，喂养Probio-M9可改善线虫健康并延长其寿命。

图3 Probio-M9具有促进健康的作用。a-d 在OP50和OP50+Probio-M9上生长的野生型N2线虫的生命周期(从卵到第一次产卵)(a)、总子代数、(b)、繁殖周期(c)和体型(d)没有显著差异(N=20，p>0.05，t检验)。e，f 喂食Probio-M9的DR信号通路突变体eat-2(ad1116)(e)和aak-2(ok524)(f)的生存曲线(N = 90只，p<0.0001，对数秩检验)。g OP50+Probio-M9培养的野生型N2线虫在第2~14天的咽泵率较OP50培养的野生型N2线虫有所提高(N=20只，p<0.01，双因素方差分析)。h 在第8-16天测定生长在OP50和OP50+Probio-M9上的野生型N2线虫的正常运动能力。根据线虫的运动，将其分为四类：A类，正常运动，自发和/或节律正弦运动(蓝条)；B类，不能移动身体，动作不规则和/或不协调(橙条)；C类，动作不协调/行动迟缓，在铂金捡丝器适度触摸时，只移动头部和/或尾巴(绿条)；D类，死虫(红条)(N≥90只，p<0.05，卡方检验)。i，j 野生型N2线虫的脂褐素积累在喂食OP50+Probio-M9后减弱。在FV1200共聚焦显微镜下观察第10天或第15天脂褐素的积累，比例尺为20 μm (i)，用ImageJ软件(j)测量荧光强度。结果以任意单位(a.u)表示(N=34只，p<0.001，t检验)。k 在OP50+Probio-M9上培养的野生型N2线虫的耐热性比在OP50上培养的存活率更高。将OP50或OP50+Probio-M9培养的成虫第5天从20℃转移至34℃，分别于12 h、18 h和24 h统计存活率(N=3个生物学实验，p<0.05，t检验)。在a-d，g，h，j和k中，数值表示为平均值±SEM。(原文图2)

3、Probio-M9的健康促进作用取决于其对宿主肠道的粘附

此外，研究了热灭活Probio-M9(95℃，30min)对线虫寿命的影响。发现，OP50+热灭活的Probio-M9无法延长线虫的寿命(图4i和补充表3)，这表明活菌状态的Probio-M9才能延长线虫寿命。综上所述，Probio-M9的健康促进作用与线虫的肠道附着有关。

图4 Probio-M9的存活率和宿主积累能力。a，c 图解说明了每次试验中使用的方法和细菌。漂白后，将卵转移到菌圈(OP50或OP50+Probio-M9)中，让其发育到L4后期或成虫(L4期后第2天或第4天)。b，d，e OP50或OP50+ Probio-M9饲喂至L4后期(b)、L4期后第2天(d)和L4期后第4天(e)的生存曲线(N=90只，p<0.05，对数秩检验)。f 在L4期后第4天喂食OP50+Probio-M9显著延长了寿命，而在L4期后第2天与喂食OP50+Probio-M9至L4期相比无显著差异(N=3个生物学实验，p<0.05，t检验)。g 菌落形成表明，Probio-M9与LGG相似地附着在线虫的肠道上(N=3个生物学实验，p>0.05，t检验)。第5天或第10天从有试验细菌的NGM平板上收集线虫，计数细菌CFU数量，表示为每只线虫的CFU。OP50和LGG作为对照。h Probio-M9对线虫肠道的积累。先用Probio-M9或对照(OP50和LGG)喂食10 d，然后转移到添加OP50的新板上。3 d后计算线虫肠道中CFU的数量，表示为每只线虫的CFU，结果表明，Probio-M9仍然附着在线虫的肠道上(N=3个生物学实验，p>0.05，t检验)。在f-h中，数值表示为平均值±SEM。i 热灭活Probio-M9(95℃ 30 min)未能延长野生型N2线虫的寿命(N=90只，p>0.05，对数秩检验)。(原文图3)

4、Probio-M9通过p38 MAPK信号通路发挥作用

为了进一步验证p38信号通路的作用，评估了Probio-M9对Toll-白细胞介素-1受体结构域的效应蛋白(TIR-1)、tir-1(tm3036)和tir-1(ok1052)两种突变体寿命的影响，这两种突变体在线虫的PMK-1上游起作用。同样，OP50+Probio-M9不能延长任何突变体的寿命(图5d，e和补充表4)。为了进一步证实，探索了Probio-M9对ATF-7的影响，ATF-7是p38信号通路中作用于PMK-1下游的转录因子。同样，OP50+Probio-M9不能延长atf-7(gk715)突变体的寿命(图5f和补充表4)，表明Probio-M9可能通过PMK-1激活ATF-7来延长线虫的寿命。总之，Probio-M9通过激活p38信号通路延长线虫寿命。

图5 Probio-M9作用于p38 MAPK信号通路延缓衰老。a-f p38 MAPK信号通路突变体nsy-1(ag3)(a)、sek-1(km4)(b)、pmk-1(km 25)(c)、tir-1(tm3036)(d)、tir-1(ok1052)(e)和atf-7(gk715)(f)在Probio-M9喂养后的存活曲线(N=90只，p>0.05，对数秩检验)。(原文图4)

5、Probio-M9下调胰岛素样信号通路

SKN-1和HSF-1作为抗应激转录因子发挥作用。为了确认喂食Probio-M9是否提高了线虫的抗逆性，延长了线虫的寿命，因此研究了两个GFP报告基因skn-1::gfp(skn-1的转录靶点)和hsp-16.2p::gfp(hsf-1的直接转录靶点)，分别反映了SKN-1和HSF-1的抗逆性。结果表明，饲喂OP50+Probio-M9的线虫肠道中skn-1::gfp的表达增加，但对hsp-16.2p::gfp没有影响(图6f-i)。此外，检测了SKN-1活性指标GST-4的表达，结果表明，与喂食OP50的线虫相比，喂食OP50+Probio-M9的线虫中gst-4p::gfp的表达增加(图6j，k)。因此，Probio-M9通过一种依赖于skn-1(而非hsf-1)的机制影响寿命延长和抗应激能力。

图6 Probio-M9诱导的寿命延长与胰岛素样信号通路的下游效应因子相关。a-e 喂食Probio-M9的胰岛素样信号通路突变体daf-2(e1370)(a)、age-1(hx546) (b)、daf-16(mgDf50)(c)、skn-1(mg570)(d)和hsf-1(sy441)(e)的寿命(N=90只，p>0.05，p<0.0001，对数秩检验)。分别用应激响应报告基因skn-1::GFP (f)和hsp-16.2::GFP (h)测试SKN-1和HSF-1。第5天，在34℃下加热20分钟，诱导hsp-16.2p::GFP报告基因表达。g，i 用ImageJ软件量化GFP的荧光强度。在OP50+Probio-M9上生长的skn-1::GFP(g)线虫的肠道荧光强度增加(N=30只，p<0.01，t检验)。Probio-M9对HSF-1(i)应激诱导反应没有影响(N=30只，p>0.05，t检验)。j，k 饲喂OP50+Probio-M9后，SKN-1活性指标GST-4的表达增加。在第5天检测gst-4p::gfp的表达(j)，用ImageJ软件测量荧光强度(k) (N=30只，p<0.01，t检验)。在f，h和j中，比例尺为20 μm。在g，i和k中，结果以任意单位(a.u.)表示，值以平均值±SEM表示。(原文图5)

6、Probio-M9作用于宿主线粒体以延长寿命

为了评估Probio-M9对线粒体膜电位的影响，使用了线粒体特异性荧光染料四甲基罗丹明乙酯(TMRE)对线虫进行染色。与OP50相比，喂食OP50+Probio-M9的线虫咽部荧光强度显著增加(图7f，g)，表明Probio-M9增加了宿主的线粒体膜电位。由于细胞膜上的膜电位是线粒体产生ATP的主要动力，喂食Probio-M9可能有助于线虫细胞和体内ATP的产生和储存。

图7 Probio-M9作用于宿主线粒体以促进健康寿命。a，b 用线粒体报告蛋白hsp-6p::gfp检测UPR^mt。hsp-6p::GFP的代表性显微照片如图a所示，使用ImageJ软件量化hsp-6p::GFP的荧光强度(b)。在OP50+Probio-M9上生长的hsp-6p::GFP线虫对肠道和尾部的应激反应能力增强(N=40只，p<0.05，t检验)。c 在UPR^mt转录因子atfs-1(gk3094)突变体中，Probio-M9赋予的寿命延长被完全废除(N=90只，p>0.05，对数秩检验)。d，e Probio-M9不能延长线虫ETC成分isp-1(qm150)(d)和nuo-6(qm200)(e)突变体的寿命(N=90只，p>0.05，对数秩检验)。f，g 使用TMRE对OP50或OP50+Probio-M9喂养的线虫进行染色，以显示线粒体膜电位。取咽部(f)，任意单位的TMRE荧光强度的统计分析如图g所示(N=30只，p<0.001，t检验)。在a和f中，比例尺为20 μm。在b和g中，结果以任意单位(a.u.)表示，值以平均值±SEM表示。(原文图6)

7、OP50与Probio-M9差异代谢物的鉴定与分析

共鉴定和量化了1253个代谢物。采用PCA、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)模型和热图评估OP50和OP50+Probio-M9之间的代谢变化。PCA评分、OPLS-DA评分图和热图显示，OP50和OP50+Probio-M9分布在不同区域，没有重叠和交叉，而是有明显的分离(图8a-c)。当代谢产物水平的变化同时满足差异倍数值(FC)≤0.5或≥2和变量重要性指标(VIP)评分阈值≥1的标准时，认为OP50和OP50+Probio-M9之间差异调节代谢产物具有统计学意义。然后用火山图表示这些代谢物(图8d)，详细内容见补充数据1。将差异显著的代谢物分为氨基酸及其代谢物、羧酸及其衍生物、有机酸及其衍生物、鞘脂类、核苷酸及其代谢物、苯及其衍生物、杂环化合物等14大类。Log₂FC值在OP50和OP50+Probio-M9之间的前十个上调和前十个下调代谢产物如图8e所示，反映了这些通路中代谢产物的变化水平。为了将Probio-M9相关变化与代谢途径相关联，使用KEGG数据库确定具有显著差异的代谢物的途径富集模式。82条代谢途径被确定为受代谢改变的影响(补充图4d)，其中20个显著变化的代谢物有助于色氨酸代谢、脂肪酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、铁沉降、半乳糖代谢和鞘脂代谢相关途径的富集(图8f)，表明这些途径可能有助于Probio-M9介导的宿主寿命延长。

图8 OP50和Probio-M9之间代谢谱的比较。a-c 代谢产物的PCA评分(a)、OPLS-DA评分图(b)和热图(c)显示OP50与OP50+Probio-M9之间差异显著，无重叠和交叉，存在明显分离。d 火山图显示了OP50和OP50+Probio-M9之间的显著代谢物。与OP50相比，紫色点表示随OP50+Probio-M9(上调)而增加的代谢物，蓝色点表示OP50+Probio-M9(下调)而减少的代谢物，红色点表示没有随OP50+Probio-M9的改变而改变的代谢物(不显著)。e OP50和OP50+Probio-M9之间变化最大的10个代谢物。与OP50相比，红色条代表OP50+Probio-M9上调的代谢产物，绿色条代表OP50+Probio-M9下调的代谢产物。f OP50与OP50+Probio-M9之间发生显著变化的代谢产物的KEGG富集分析(点的颜色代表p值，颜色越红，富集程度越显著；点的大小表示该通路中富集的代谢物的数量)。(原文图7)

讨论

本研究发现，喂食母乳源鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9，可以延长模式生物秀丽隐杆线虫的寿命(图9)。喂食活菌状态的Probio-M9，而不是热灭活Probio-M9，可以改善线虫的健康。Probio-M9通过调节p38级联和daf-2信号通路延长线虫的寿命，不依赖daf-16，但依赖于skn-1。通过激活UPR^mt，保护和修复受损的线粒体，以维持代谢的稳定。同时，氨基酸代谢、鞘脂代谢、半乳糖代谢和脂肪酸代谢可能参与了Probio-M9介导的线虫寿命。

图9 线虫中喂养Probio-M9调控的信号通路示意图。活的Probio-M9喂食通过胰岛素/IGF-1信号通路(DAF-2/SKN-1)和p38 MAPK信号通路(NSY-1-SEK-1-PMK-1)延长线虫的寿命。它还触发线粒体未折叠蛋白反应(UPR^mt)以维持线粒体内稳态。因此，喂养Probio-M9可以通过提高线虫的抗应激能力、激活防御系统、提高UPR^mt来延长其寿命。(原文图8)

结论