细菌VBNC态的研究进展

1. 细菌VBNC态介绍  

细菌“活的非可培养态(Viable but non-culturable，VBNC)”的概念于1982年首次被徐怀恕等提出。细菌的VBNC态指细菌在不良环境条件下会进入异常的生理状态，这种状态下细菌仍有代谢活性，采用常规平板计数方法培养时不能生长繁殖，但当给予适当条件时能复苏并恢复至可培养状态。这一概念在微生物领域一提出就受到了极大的关注，目前已经报道了42个属87种细菌存在VBNC态（如表1）^[1]，其中大部分为革兰氏阴性致病菌，对革兰氏阳性菌的研究并不多见，表2列举了部分已报道的存在VBNC态的乳酸菌菌株^[2]。许多环境压力或营养条件的剧烈改变都可以诱导细菌进入VBNC态，如温度、pH值、营养条件、紫外线强度、干燥条件、溶氧量、湿度等^[3]。

表1 已报道存在VBNC态的细菌

表2  存在VBNC态的乳酸菌菌株汇总

2. VBNC态细胞的生理特性

2.1细胞形态变化

细菌为了应对某些恶劣环境，细胞内部会发生变化，并且在细胞形态上也会有所体现。目前报道的VBNC态细菌形态变化包括细胞体积缩小，由杆状变为球体或者菌体的轻微拉长等，本实验室诱导具有自主知识产权的酸奶发酵剂Lb. bulgaricus ND02进入VBNC态前后的扫描电镜照片见图1^[4]，可以观察到Lb. bulgaricus ND02在进入VBNC态后菌体明显缩小且表面有褶皱。

图1  Lb. bulgaricus ND02扫描电子显微镜图像

注：A. 正常态；B. VBNC态

2.2 代谢活性的变化

VBNC态细菌在恶劣环境中仍保持代谢活性，但是会发生许多新陈代谢的变化，包括营养物质运输的减少、大分子合成的减少以及呼吸速率降低等。Ganesan发现Lac. lactis ML3，Lac.lactis IL 1403和Lac. cremoris SK11在缺少碳水化合物的条件下会进入VBNC态，在此状态下细菌可以保持完整的细胞结构和代谢活性超过3.5年，也证明了VBNC 态细菌生存所需的能源和代谢产物主要通过支链氨基酸的分解供给环境^[5]。Lahtinen报道在双歧杆菌B.longum 46、B. longum 2C 和 B. animalis subsp. lactis Bb-12发酵产物的贮藏期间，双歧杆菌会逐渐丧失可培养性而进入VBNC态，同时胞内大分子的合成量和呼吸率也随之降低，但胞内的ATP和膜电位会仍然保持较高的水平。

3. 细菌VBNC态的形成机制

尽管细菌VBNC态形成的分子机制尚未明确，但在VBNC态细菌中发现了几个有着重要意义的基因，这些基因在细菌VBNC态的形成过程中起着不可或缺的作用。值得一提的是RpoS基因，由RpoS基因表达的主要应激调节剂RpoS（σS）是一种稳定性的σ因子，使得细菌在不同的环境胁迫（如酸、高渗透压、富氧和饥饿条件）下得以生存。这种能力意味着RpoS可以提高细胞适应环境的能力，并且阻碍细菌VBNC态的形成，需要注意的是并不是所有的细菌都具有RpoS基因。

近期发表的一篇综述中总结了目前人们对细菌VBNC态形成的基因调控机制的假设（如图2）^[6]：第一，RpoS蛋白抑制VBNC态细菌的形成，增强了细菌的持久性；第二，（p）ppGpp可能是能使细菌快速进入VBNC态的诱导剂；第三，进入VBNC态之前，正常细胞将处于持久状态。

这些细菌VBNC态形成机制的的得出主要来自假设和推理，这些研究侧重于单个细胞和个体机制，缺乏全面且系统的分析。大多数文献对单一转录组学方法进行了研究，二者均缺乏整合分析，难以实现信息补充和功能验证。高通量测序技术和生物信息学的发展和应用，为全面深入地了解VBNC状态的形成机制提供了有效的技术手段。

图2  VBNC态细菌形成机制的不同观点

4. VBNC态细菌的复苏

复苏是细菌VBNC态的一个重要特征，复苏的细菌恢复可培养性。事实上，复苏是一个复杂的过程，不是通过直接去除诱导因素就能实现的。并不是所有的VBNC态菌株都能够被复苏。不同的细菌的复苏条件是不同的，因此只有在合适的条件下，VBNC细胞才能实现复苏。

5. VBNC态细菌的复苏机制

与VBNC态细菌复苏相关的争论已经持续了很久：细菌的可培养状态是由VBNC态细菌的真实复苏引起的，还是由于平板计数法无法检测到残余的可培养细胞的再生长所造成的。残留的未检测到的可培养细胞和VBNC态细胞的差异在于前者保留了可培养性。迄今为止，没有有效的方法来区分复苏细胞和正常细胞的可培养性，因此对于VBNC细胞的复苏还存在争议。

虽然VBNC态细菌的复苏机制仍然在是未知的，但对VBNC态细菌复苏的研究有了新的进展，随着分子生物学技术的发展人们对VBNC态复苏机制有了的更多了解。研究表明，复苏促进因子（Rpf）是由220个氨基酸组成的高度保守的蛋白质，且与VBNC态细菌复苏直接相关，可以恢复VBNC态细菌的生长和繁殖能力。目前关于Rpf的机制有两个观点（如图3）：一种观点是Rpf切割分布在休眠细胞壁的特定区域中的抑制性的肽聚糖，从而促进细胞分裂和生长复苏。另一种观点是Rpf的肽聚糖的分解产物可能与其他因子相互作用，并起到“第二信使”的作用，以刺激VBNC态细菌的复苏和生长。然而，Rpf及其分解产物的机制仍不清楚并需要进一步研究。 

图3  关于Rpfs复苏机制的两种观点

6.结语

越来越多的细菌被发现有VBNC 态。由于VBNC态的细菌用常规的方法检测不到，容易在实际检测中造成漏检。尤其是VBNC态的致病菌仍然会有致病性和抗原性，如果遇到适宜条件它们会复苏而继续繁殖，对食品安全和人类健康带来了很大的威胁。随着人们对VBNC态细菌研究领域的不断扩大，许多乳酸菌也渐渐被证实存在着VBNC态。对VBNC态乳酸菌进行更深入的研究，可以为今后乳酸菌在工业生产、贮藏和应用过程中保持高活性状态提供新思路和新方法。

参考文献

[1]蒋娜, 番茄溃疡病菌VBNC状态的诱导、复苏及机制研究[D], 中国农业大学, 2016.

[2]王亚利, 包秋华*(通讯作者), 王俊国, 张和平. 德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02活的非可培养态的诱导和复苏[J]. 食品科学, 2017, 38(6):68-73. (EI 收录)

[3]Trevors J T. Viable but non-culturable (VBNC) bacteria: Gene expression in planktonic and biofilm cells[J]. Journal of Microbiological Methods, 2011, 86(2): 266-273.

[4]王亚利, 德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02活的非可培养态的研究[D], 内蒙古农业大学, 2017.

[5]Ramamurthy T, Ghosh A, Pazhani G P, et al. Current perspectives on viable but non-culturable (VBNC) pathogenic bacteria[J]. Frontiers public health, 2014, 2:103-112.

[6]Xihong Z, Junliang Z, Caijiao W, et al. Current Perspectives on Viable but Non-culturable State in Foodborne Pathogens[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8 (4) :580-596.