乳杆菌烈性噬菌体的灭活研究

研究背景

乳杆菌广泛分布于人、动物和植物中，在机体的代谢、免疫调节等方面起着极其重要的作用，是应用广泛的食品级微生物。但所有依赖乳杆菌进行生产的行业都面临噬菌体污染问题，特别是食品加工制作业和生物工业。乳品发酵工业中常使用热处理及化学杀菌剂对原料及设备进行杀菌消毒，与此同时若可使噬菌体失活则可有效减少噬菌体对工业生产造成的威胁。因此，探究热处理与化学试剂对乳杆菌烈性噬菌体的灭活效果，对发酵工厂预防和防治噬菌体污染具有一定的指导作用。

实验设计

1.      不同温度对噬菌体P1的灭活效果

将噬菌体裂解液分别与脱脂乳（RSM）、MRS、三镁明胶（TMG buffer）培养基混合于微量离心管中（终体积为1 mL）摇匀，在不同温度（63 ℃、72 ℃、90 ℃）条件下培养。于不同时间间隔（0、10、20、 30、40、50、60 min）取出并采用双层平板法计数，37 ℃培养16-18 h，观察噬菌斑，绘制噬菌体灭活曲线。并根据灭活曲线计算T₉₉值，即灭活99%噬菌体所需时间。

2.      化学杀菌剂对噬菌体P1的灭活效果

将噬菌体裂解液分别与不同浓度的乙醇（10％、20％、30％、50％、75％、Absolute），异丙醇（10％、30％、50％、Absolute），次氯酸钠（100、200、400、800 ppm）以及过氧乙酸（0.15％、0.25％、0.45％）混合于微量离心管中（终体积为1 mL）摇匀，37 ℃培养。于不同时间间隔（0、10、20、 30、40、50、60 min）取出并计数， 37 ℃培养16-18 h，观察噬菌斑，绘制噬菌体灭活曲线。根据灭活曲线计算T₉₉值。

实验结果

1.  不同温度对噬菌体P1的灭活效果

表1. 乳杆菌烈性噬菌体P1在不同温度不同培养基中的T99值

图 1 不同温度不同培养基处理下噬菌体P1的灭活曲线

由表1、图1可知，噬菌体P1在63℃显示出相对较强的耐热性，40 min后才可完全失活（减少8个对数级）；T₉₉值的范围在7.55-9.89 min之间。72℃处理时，该噬菌体的抗热性显著下降，10 min即达到完全失活（T₉₉<5 min）。当温度提高到90℃时，5 min即可使其降低到10 pfu/mL以下。

比较不同培养基对噬菌体P1热耐受性的影响可看出，不同培养介质对噬菌体P1显示出不同的保护效果。相同灭活温度下，脱脂乳具有最好的保护作用，MRS保护作用最差。

2.      化学杀菌剂对噬菌体P1的灭活效果

表 2. 乳杆菌烈性噬菌体P1在不同杀菌剂中处理时的T99值

表2为不同杀菌剂处理噬菌体P1的T₉₉值，其与灭活剂的种类及浓度有关。由该表可知，乙醇浓度为10%、20%、30%时T₉₉值均大于60min，显示出对P1较小的灭活效果。无水乙醇处理时，存活的噬菌体粒子数急剧下降，T₉₉值达到最低（6.48 min）。由此可知，在短时间内无水乙醇对噬菌体P1的灭活效果较好。在异丙醇浓度为10%时，T₉₉值大于60min。与乙醇相似，随着异丙醇浓度的增加，T₉₉值显著降低，其灭活效果增强。800 ppm次氯酸钠显示出较好的灭活效果，可使噬菌体P1在10 min内下降2个对数级（T₉₉<10 min）。相比较来看，噬菌体P1对过氧乙酸具有较强抗性，0.45%过氧乙酸处理时其T₉₉值仍为21.74 min。

2.1      不同浓度醇类物质对噬菌体P1的灭活效果

图 2 不同浓度醇类物质对噬菌体P1的灭活效果

由图2可知，随着醇浓度的增加，其对噬菌体的灭活效果整体呈现上升趋势。10％乙醇和10%异丙醇对噬菌体P1无太大影响，存活粒子数变化趋势趋于平缓（T₉₉>60 min）。30%乙醇处理60 min后，噬菌体数量达到最低（5.42 lg pfu/ mL）。30%异丙醇（T₉₉ =30.83 min）的灭活效果优于30%乙醇（T₉₉>60 min），30%异丙醇处理60 min后，存活噬菌体数量降至4.40 lg pfu/ mL。75%乙醇（T₉₉ = 8.15 min）比50%乙醇（T₉₉= 16.86 min）对噬菌体P1显示出更好的灭活效果。虽然，无水乙醇、无水异丙醇可对该噬菌体产生较高的灭活效果，但却不能在60 min内使其完全失活。另外，从经济角度考虑，这种处理方式也不适用于工业生产中。相关研究表明，醇类物质主要是通过破坏病菌的脂质层表面使微生物失活。对于噬菌体而言，醇类物质可能通过破坏蛋白质肽健，改变噬菌体的衣壳蛋白结构，使之变性，但却未对核酸造成损伤，因此未能使噬菌体完全失活。

2.2       不同浓度次氯酸钠对噬菌体P1的灭活效果

图 3不同浓度次氯酸钠对噬菌体P1的灭活效果

次氯酸钠主要是通过改变噬菌体衣壳结构、聚集噬菌体尾部蛋白阻止噬菌体DNA的释放，引起噬菌体失活。由图3可知，100 ppm的次氯酸钠对噬菌体P1几乎无影响（T₉₉>60 min），处理60min后噬菌体数仍可达7.18 lg pfu/ mL。200 ppm和400 ppm的次氯酸钠对噬菌体P1虽有一定影响，但在30 min后都不同程度地趋于平稳。800 ppm的次氯酸钠对噬菌体P1的影响较大，灭活速度最快（T₉₉=7.70 min），处理60 min后可使其完全失活。

2.3      不同浓度过氧乙酸对噬菌体P1的灭活效果

图 4不同浓度过氧乙酸对噬菌体P1的灭活作用

过氧乙酸的活性成分为乙酸和过氧化氢，由于其溶液极端的酸性pH值，可使微生物的蛋白质和酶类失活。由图4可知，0.15％过氧乙酸对噬菌体P1没有明显的灭活效果（T₉₉>60 min）。当用0.25%过氧乙酸处理60 min后，可观察到P1下降了约2.5个对数级，T₉₉值为51.83 min。0.45%过氧乙酸对该噬菌体有一定的灭活效果（T₉₉=21.74 min），60 min处理后可使其下降约4个对数级，但仍未能达到完全灭活。

结论

63℃40 min，72℃10 min或90℃5min的高温处理可使噬菌体P1完全失活。不同培养基对噬菌体P1显示出不同的热保护效果，其中脱脂乳的保护效果最好。  

多种化学杀菌剂中灭活效果最好的是800 ppm次氯酸钠，处理60min可使噬菌体P1完全灭活。乙醇、异丙醇、过氧乙酸均不能使该噬菌体在60 min内完全失活。