培养条件对乳酸菌发酵剂抗冷冻干燥性能影响的研究

摘  要：乳酸菌发酵剂应具有高活力、耐贮藏性以及对不同环境的适应性，特别是在冷冻干燥过程中活性的保持。本文从乳酸菌发酵剂菌种的内在特性、培养时间、培养基成分、培养温度及pH值的变化等方面综述了不同培养条件对乳酸菌发酵剂抗冷冻干燥性能影响的研究进展。说明乳酸菌在冷冻干燥中的存活率依赖于它的内在基因，基因差别决定了不同的乳酸菌对冷冻干燥的抗性存在差异；同时与细胞膜成分以及菌株形态有一定的关联；通常生长在稳定期的乳酸菌其抗冷冻干燥能力较强；培养基成分对菌株的影响因菌株不同而异；较低的培养温度和pH值，有助于提高乳酸菌的抗冷冻干燥性能。本文为提高乳酸菌的冻干存活率提供一些参考。

关键词：乳酸菌发酵剂；冷冻干燥；不同培养条件；存活率 

近些年来，乳酸菌发酵剂的制备主要依靠冷冻干燥技术，它被认为是最方便和最成功的方法，但在冷冻干燥过程中，乳酸菌发酵剂不可避免地会受到冷冻和干燥带来的各种损伤，导致菌株存活率降低、活力下降，进而造成生产成本的增加，产品质量不稳定等问题。因此如何提高菌株在冷冻干燥过程中的存活率是制作高效浓缩型乳酸菌发酵剂的核心技术之一，但由于我国在此项关键技术的缺失，导致目前国内乳品企业生产发酵乳制品所采用的乳酸菌发酵剂几乎全部被国外企业所垄断。我们从菌种的内在特性、培养条件等方面分析了影响乳酸菌发酵剂抗冷冻干燥的一些因素，为我国生产拥有自主知识产权的高效浓缩型乳酸菌发酵剂提供一定的理论参考。

1  乳酸菌的内在特性

1.1  遗传物质

微生物的冷冻干燥存活率依赖于它的内在基因，这种基因差别决定了不同的乳酸菌对冷冻干燥的抗性存在差异，有些特定的菌株对冷冻干燥特别敏感，常常在冻干后丧失了活性。但对大多数乳酸菌而言，对冷冻干燥未显示出特别的敏感性。研究表明在冷冻干燥过程中，细胞内的大分子物质如DNA、RNA及核糖体等将受到影响，这将导致遗传物质的转录、翻译、DNA的复制以及蛋白质的合成出现问题。

1.2  细胞膜结构

细胞膜中较高含量的不饱和脂肪酸或环丙烷化脂肪酸（cycC19∶0）有助于增强菌株的抗冷冻能力。不饱和脂肪酸的熔点较低，可以保持菌株在冷冻过程中细胞膜的流动性，从而起到维持细胞膜的功能，增强其抗冷冻性。关于环丙烷化脂肪酸的作用有所争论：有些人认为同不饱和脂肪酸的作用一样，体现在增加细胞膜的流动性上，当冻干时其能防止脂肪酸过紧地结合到细胞膜上；也有人认为与顺式双键的结构相比，环丙烷的环状结构会使膜变得僵化，流动性下降，它约束了酰基链的移动和失序，从而防止了在冷冻干燥过程中膜的完整性受到破坏。因此，可通过测定菌株细胞膜中脂肪酸的组成成分及其含量判断不同菌株的抗冷冻能力。

1.3  菌株形态

研究发现，菌体细胞形态、大小对冷冻干燥过程中乳酸菌的存活率有一定的影响，如形状呈小球型的球菌比长杆状的杆菌对冷冻干燥具有更强的抵抗力；短棒状杆菌比长纤细状杆菌对冷冻干燥抵抗力强。出现这些现象的原因可能是乳酸菌细胞的表面积越大，在冷冻过程中，形成的冰晶对其细胞膜的机械损伤越大。但对于明串珠菌与保加利亚乳杆菌来说恰恰相反，在相同的冻干条件下，明串珠菌的活力要远远低于杆菌的，这说明抗冷冻干燥性能和菌株间的形态、遗传物质及细胞膜组成等多种因素密切相关。 

2  培养时间

研究表明，处在不同生长期的菌株对冷冻干燥的抗性有很大的差别。生产乳酸菌发酵剂最理想的培养时间因具体菌株而异。一般来说，乳酸菌通常生长在对数期末期或稳定期早期，除了考虑在此阶段收获的活菌数最多外，还有一个原因是处在这个时期的菌株在冷冻干燥过程中其存活率较高。有研究表明，处在幼龄期和老龄期的菌体细胞在冷冻干燥过程中，死亡率较高，而处在对数生长末期和稳定期前期的菌体细胞其存活率较高。Nagawa等研究发现，对处于稳定期早、末期的长双歧杆菌进行冷冻干燥，其处于稳定早期的活菌数是处于后期的100 倍。Bisutti等也得到相似的结论，造成这一现象的原因可能是对数生长末期和稳定前期的菌体细胞生长代谢最旺盛、活力也最强，与其他生长阶段的菌体细胞相比，耐受不良环境的能力也要强。进一步的研究显示，处在稳定期的菌株对冷冻干燥的抗性要强于对数生长期的。Teixeira等比较了生长在对数期和稳定期的保加利亚乳杆菌对干燥的抗性，结果显示，其干燥后的存活率分别是5.80lg CFU/mL 和7.45lg CFU/mL；Rault等在实验中证明了保加利亚乳杆菌CFL1处在稳定期的抗冷冻性好于其处于对数期；Louesdon等对长双歧杆菌RO175的研究也揭示出在稳定期收获的菌株抗冷冻干燥性能要明显好于对数期的。产生这些现象的可能原因有：处在稳定期的菌株因为碳源或其他可利用营养物的耗尽，从而诱导微生物产生应激反应，提高了其对不良环境的抗性；同时在特定环境下，细胞膜脂类成分发生改变，如Velly、Louesdon等证实了与处在对数期的乳酸菌相比，稳定期菌体的细胞膜成分发生了改变，环丙烷化脂肪酸（cycC19∶0）的含量显著增加，从而使菌株抗冷冻干燥性能增强。然而，Palmfeldt等对稳定期早、中、晚期的罗伊氏乳杆菌进行冷冻干燥，结果发现其存活率没有明显的差别；同样Louesdon等对分别处在对数期和稳定期的布氏乳杆菌R1102进行抗冷冻干燥存活率的测定，并没有发现二者存在显著差异。这些现象的出现可能是由于不同菌株间的差异造成的。以上综述表明，一般情况下，处在稳定生长期的乳酸菌其抗冷冻干燥性能要强于其他生长阶段，同时也要考虑到菌株间的特异性。

3  培养基成分

人们在早期的研究中关注的是保护剂和不同生长阶段对乳酸菌抗冷冻干燥性能的影响但近来研究发现，乳酸菌在冷冻干燥过程中的存活率与其生长培养基的成分也有着十分密切的联系。

3.1  碳源和氮源

Li Chun等发现与不含葡萄糖的MRS生长培养基相比，添加单糖（果糖、葡萄糖）或双糖（乳糖、蔗糖）可以明显提高保加利亚乳杆菌L2的冷冻干燥生存率；Carvalho等发现当用果糖、乳糖或甘露糖替代MRS培养基中的葡萄糖时，保加利亚乳杆菌具有更好地抗冷冻干燥性能，其中甘露糖的效果最好；我们实验室在研究植物乳杆菌LIP的抗冷冻干燥性能时，分别用果糖、乳糖、蔗糖替代MRS培养基中的葡萄糖，发现蔗糖的效果最好，见下图1；通过以上实验验证合适的碳源可以增强菌株抗冷冻干燥的能力。

对于细菌的抗冷冻干燥性能，氮源同样起到非常重要的作用，Senz等调整MRS培养基的配方，加入一定量的猪源蛋白胨，发现可以明显改善嗜酸乳杆菌NCFM 抗冷冻干燥性能；我们实验室分别选取大豆蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、乳清粉等6种物质作为植物乳杆菌LIP生长氮源，结果发现当利用大豆蛋白胨作为其生长氮源时效果最佳，见下图2；碳水化合物对菌体的保护作用也有可能得益于它具有羟基基团的空间结构，大量的羟基可以代替水分子，通过氢键与蛋白质的极性基团结合维持菌体蛋白质的空间结构，防止在冷冻干燥过程中由于脱水而导致的蛋白质变性。

图1 不同碳源对植物乳杆菌冷冻干燥性存活率的影响

图2 不同氮源对植物乳杆菌冷冻干燥存活率的影响

3.2  相容性物质

一些研究发现，当乳酸菌在含有特定成分的培养基中生长时，能从生长培养基中吸收些相容性物质，这些相容性物质的存在不影响细胞正常的功能，并能通过调节乳酸菌细胞内的渗透压来保护细胞膜和蛋白质等成分进而增强菌体的抗冷冻干燥能力。乳酸菌自身不能合成这些物质，同时它们进入菌体是个耗能过程，需要有糖类等作为能量来源，而冷冻干燥过程时间太短，不足以使菌体积累这些物质，所以乳酸菌只能从生长培养基中吸收这些相容性物质或它们的前体物质。这些相容性物质通常是一些小的有机化合物，包括一些氨基酸（谷氨酸、脯氨酸等）、季铵盐（甜菜碱、肉毒碱等）和一些糖类（蔗糖、海藻糖等）。Santivarangkna等认为相容性物质的存在，加强了水分子与细胞内生物大分子物质的亲和性，从而维持了蛋白质的结构、酶的活性以及细胞膜磷脂的稳定性，进而改善了菌株在冷冻干燥中的生存率。相容性物质的吸收与培养基的渗透压有一定的关联，增加培养基的渗透压可以促进相容性物质的吸收。

4  培养温度以及pH值

大量证据表明细胞膜的脂肪酸构成和流动性与生长环境有着一定的关联性。在乳酸菌培养过程中当发酵条件（如温度和pH值等）发生改变时，乳酸菌会调整膜中脂类的成分来保障磷脂双分子层膜的流动性，以便使磷脂双分子层膜保持在一个理想的状态，从而维持细胞的正常功能。

4.1  培养温度

Wang等发现较低的发酵温度使嗜酸乳杆菌RD758具有更好的抗冻性，与42 ℃的生长温度相比，当温度为30 ℃时，在冷冻过程中其存活率较高；其在冷冻贮藏期间发酵温度为30 ℃或37 ℃较42 ℃的抗冻性更强；由于菌株存在一定的差异性，我们实验室发现植物乳杆菌LIP在37 ℃时具有更好的抗冻性，见下图3，以上研究表明，在相对低的温度下，细胞膜中脱氢酶的活性增加，导致不饱和脂肪酸含量增加，膜的流动性增强。但值得注意的是，细胞膜中较高含量的不饱和脂肪酸容易造成乳酸菌在贮藏期间氧化失活，特别是当水分含量较低时。低温培养提高抗冻性的另一原因是促进某些乳酸菌菌体多糖的合成。如嗜热链球菌在30 ℃比40 ℃培养时产生的不溶性多糖高2～5 倍，这种物质可提高冷冻干燥存活率。

图 3 不同培养温度对植物乳杆菌冷冻干燥存活率的影响

4.2  培养pH值

Beal等发现发酵pH值为5.5时，嗜热链球菌有较好的抗冷冻性，对不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例分析发现，较低的pH值可以引起细胞内不饱和脂肪酸的积累。值得注意的是并非所有的菌株都能在低酸或低温下，其抗冷冻性得到增强。为了研究培养pH值对乳酸菌细胞膜脂肪酸以及抗冷冻干燥性能的影响，将稳定期的罗伊氏乳杆菌I5007放入pH 6.7的MRS培养中培养6 h后，与对照组（pH 5.7）相比其冷冻存活率从12.95%提高到27.38%；我们实验室同样发现当植物乳杆菌LIP生长在初始pH为6.8时其抗冻性更强，活力下降更少，见下图4，分析发现这与细胞膜中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例（UFAs/SFAs）的明显提高有关。

图 4 不同pH对植物乳杆菌冷冻干燥存活率的影响

5  结  语

在冷冻干燥过程中，乳酸菌的存活性受到内在与外在多种因素的影响。从内在因素分析，首先取决于乳酸菌的内在基因，在此基础上与细胞膜的脂肪酸构成以及细菌的形态有一定的关联性，总体而言，细胞膜中高含量的不饱和脂肪酸及环丙烷化脂肪酸有助于提高菌体的抗冷冻干燥能力，形状呈小球型、短棒状的乳酸菌抗冷冻干燥能力略强。对外在的培养条件而言，处在稳定生长期的乳酸菌其抗冷冻干燥性能要强于其他生长阶段；培养基的碳源和氮源对不同菌株的影响各不相同，选择合适的碳源和氮源可以增强菌株抗冷冻干燥的能力；添加适量的Ca2＋以及吐温-80可以增强菌株的抗冷冻干燥能力；同样对处在稳定生长期的乳酸菌而言，培养基营养成分的缺失可以增强菌株的抗冷冻干燥能力；选择适当的培养温度和培养pH值，可以提高菌株抗冷冻干燥性能，对一些乳酸菌来说，在较低温度、pH值的条件下培养可以提高其抗冷冻干燥能力。