益生乳酸菌Lactobacillus plantarum P-8研究专题----基础研究篇

L. plantarum P-8分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗草原上牧民家庭自然发酵酸牛乳样品，是研究人员2005年从内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库中的347株植物乳杆菌中优选出的1株具有优良益生特性的植物乳杆菌。

L. plantarum P-8具有优异的耐受胃酸、肠液和胆盐能力。通过体外模拟实验发现：该菌株经过胃肠道消化后存活率高达94.87%，可耐受的最大胆盐浓度为1.8g/100mL。

Ann Microbiol. 2012, 62(3):1311-1320

采用全基因组鸟枪法测定了L. plantarum P-8全基因组序列，结果显示：该菌株基因组由1条染色体和6个质粒组成。染色体长度为3.03Mbp，G+C含量为44.80%，共编码3009个开放阅读框，包括5个rRNA基因簇和65个tRNA基因。6个质粒长度分别为51,183 bp、46,574 bp、39,469 bp、30,687 bp、16,104 bp和8,686bp，分别编码73、54、47、36、26和12个开放阅读框。

J Biotechnol. 2015, 193:41-42

共轭亚油酸是普遍存在于人和动物体内的营养物质。研究证明：共轭亚油酸具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力、降低胆固醇和促进生长发育等生理功能。

将L.plantarum P-8经过N+离子束诱变后得到高产共轭亚油酸(CLA)突变菌株，最高产CLA浓度为0.275 mg/mL，转化率为27.51%。      

对L.plantarum P-8产CLA的培养时间、亚油酸添加量以及培养基成分进行系统优化，结果发现：L. plantarum P-8培养22h，亚油酸添加量为0.9mg/mL，接种量为1.5%，氮源采用2g/L的胰蛋白胨，碳源采用3g/L的葡萄糖时，共轭亚油酸产量最高可达69.2 μg/mL。

基因组分析发现：L. plantarum P-8 含有亚油酸异构酶基因，基因全长1695bp，G+C含量为44.25%，编码564个氨基酸，编码蛋白的理论分子质量为64.2kD，理论等电点5.37。

在此基础上，我们构建了乳酸克鲁维酵母工程菌株，这是国内首次以 L. plantarum P-8克隆出亚油酸异构酶基因并在乳酸克鲁维酵母中得到分泌表达。

食品科学, 2011, 32(17):297-302

生物学杂志, 2012, 29(3):92-95

饲料工业, 2016, 6(37):51-53

工程菌来源：以L. plantarum P-8为出发菌株，通过150天的适应性进化实验获得了可以快速代谢棉籽糖的工程菌。 

由pH值和OD值变化规律可知，L. plantarum P-8工程菌对数生长期较原始菌株提前2h，比生长速率显著高于原始菌株。  

为了更好地将工程菌用于豆粕饲料的加工生产，采用比较蛋白组学技术对其棉籽糖代谢分子机制进行了深入研究。 

工程菌可以快速分泌α-半乳糖苷酶，特异性切断棉籽糖的非还原性末端α -1,6半乳糖苷键。半乳糖单元释放后，可以通过莱洛伊尔（Leloir）途径代谢降解。  

基因组重测序结果显示：与原始菌株相比，工程菌α-半乳糖苷酶编码基因上游调控区域出现SNP位点。已有研究表明， α-半乳糖苷酶编码基因的表达由自身特定启动子起始，可以推测该位点与其高表达密切相关。 

工程菌具有更高的谷氨酸和天冬氨酸代谢活性，有利于减少酸胁迫对细胞造成的损伤。这些代谢关键酶均差异表达，细胞内含量显著（ P < 0.05 ）高于原始菌株。

Scientific Reports 2016, 6:31403

将L. plantarum P-8在普通和碳源限制性MRS培养基中连续传代1000代，并对其表型特征的稳定性进行评价。

结果表明：L. plantarum P-8在两种培养基中的细胞形态没有发生变化；活菌数、浊度和菌株活力等评价指标差异不显著。表明L. plantarum P-8具有良好的稳定性，有利于其在产业化生产中的应用。

中国乳品工业, 2013, 41(4):15-18

中国食品学报, 2015, 15(5):20-26

采用二代高通量测序技术和蛋白质组学技术完成了1000代-8000代L. plantarum P-8适应性菌株的比较分析。L. plantarum P-8在葡萄糖限制性培养基中的平均相对适应性显著高于常规培养基(P<0.05)，适应性突变积累的速度更快(P<0.05)。且大部分突变位点富集于氨基糖、核苷酸糖及糖酵解代谢途径。  

蛋白质学研究发现，在适应葡萄糖限制性环境过程中L. plantarum P-8采用改变细胞壁结构、提升碳水化合物代谢效率、增加氨基酸积累等多种行为方式提高自身存活率。  

有趣的是，菌株棉籽糖代谢关键蛋白α-半乳糖苷酶表达伴有周期性波动现象，与L. plantarum P-8适应性菌株棉籽糖代谢速率周期性提高的理化实验结果一致。表明细胞在受到选择压力时，可特异性的产生能使选择压力得到缓解的有益突变，克服短期进化过程中的不利因素。该研究成果为乳酸菌产业化生产工艺的优化提供了新的借鉴和思路。

J Proteomics 2018, 176:37-45