张和平：肠道菌群宏基因组研究产品 落地回馈奶牛养殖
时间：2016-10-31 来源： 作者： 浏览次数：1858
抗生素滥用已成为世界性难题，每年由于抗生素滥用给人类带来数十亿美元的损失，因此世界各国相继出台法律法规禁止抗生素滥用，这对于畜牧人来说既是机遇也是挑战。牛场管理、病原菌感染和奶牛体质等因素都可能造成奶牛乳房炎（体温升高，乳房红肿痛，体细胞数（SCC）升高，牛乳呈棕黄色，脓浆），导致巨额经济损失、增加细菌耐药性、抗性基因污染，最终威胁食品安全（见图1）。因此对益生乳酸菌在奶牛养殖中应用研究具有重要意义。
1、健康奶牛与乳房炎奶牛肠道菌群定量与宏基因组研究
1.1研究方法
（1）利用实时荧光定量PCR技术，对36头健康奶牛（SCC<30万/mL）与36头患乳房炎奶牛SCC>100万/mL）的肠道菌群与乳腺菌群中细菌和真菌总量，及大肠杆菌和葡萄球菌等常见的乳房炎致病菌属，双歧杆菌与乳杆菌属为代表的肠道有益菌属进行定量分析，探究两组奶牛各种属数量上的差异。
（2）选取健康组(CH，20头 ，SCC< 30万/mL)，乳房炎组(CM，20头， SCC>100万/mL) ，采用二代、三代测序技术相结合的方法从宏基因组角度完成了40头奶牛粪便中微生物多样性和Metagenome分析，探究揭示乳腺炎与奶牛肠道微生物及功能基因的关系。
1.2 结果
（1）链球菌属Streptococcus、肠球菌属Enterococcus、大肠杆菌E. coli数量在乳房炎组较高，而乳酸乳球菌Lactococcuslactis、乳杆菌属L actobacillus、双歧杆菌属Bifidobacterium等有益菌的数量在健康组中较高；布氏乳杆菌L.buchneri、干酪乳杆菌L.casei、清酒乳杆菌L.sakei、唾液乳杆菌L.salivarius等12种乳杆菌种在健康奶牛肠道以及乳腺中的含量较高；肠道中乳杆菌属Lactobacillus，双歧杆菌属Bifidobacterium与乳头中的葡萄球菌属Staphylococcus、肠球菌属Enterococcus、大肠杆菌E.coli以及乳体细胞数均呈负相关（见表1）。
（2）基于三代测序技术完成健康组、乳房炎患病组共40头奶牛肠道微生物组成分析，共识别出319个细菌种，平均相对含量在0.1%以上的菌种共有28个。其中蝙蝠弧菌属Vampirovibrio在乳房炎组含量高，该菌可引起轻度腹泻与红细胞溶血。真杆菌属Eubacterium，颤螺旋菌属Oscillibacter等产酸菌在健康组含量较高。α多样性分析结果与Mann-Whitney检验发现，健康组微生物物种丰度和多样性显著高于乳房炎组，乳房炎组奶牛肠道微生物结构趋于简单化。
2、无菌小鼠模型进行健康奶牛与乳房炎奶牛肠道菌群移植实验
2.1动物实验设计
在奶牛肠道菌群结构与功能研究基础上，进一步验证肠道菌群与乳房炎发病的关联。以4月龄无菌C57BL/6J孕鼠为动物模型进行奶牛粪菌移植实验。采集乳房炎奶牛粪便12份，健康奶牛粪便12份，两组奶牛粪便混合后进行移植实验。孕鼠产前3天进行相应的实验干预，直至25天实验结束 。实验设计流程见图2。
2.2 结果
（1）移植乳房炎奶牛粪菌的M组小鼠乳头明显观察到红肿现象，有炎症发生。移植健康奶牛粪菌的H组小鼠乳头外观与移植乳房炎奶牛粪菌+益生菌的Z组小鼠乳头外观没有红肿现象。H组腺泡清晰整齐，M组腺泡损伤，Z组腺泡较M组完整。M组乳腺组织IL-6,MPO,TNF-a含量均显著高于H组，而Z组的IL-6与TNF-a含量显著高于M组，结果表明益生菌干预提高了机体免疫应答强度，尤其显著提高IL-6的含量，从而对乳腺炎症起到防治作用。
（2）结肠IL-1β，空肠中IL-6和TNF-a的含量在三组小鼠中均存在显著差异，尤其IL-1β的含量为 M组>Z组>H组。这表明乳房炎奶牛肠道菌群中致病菌的含量较高，并对肠道产生较强的刺激，引起机体产生了强烈的免疫应答反应，而益生菌的摄入可以缓解该症状。
（3）血清中IFN-y，IL-4，L-10，IL-17，LZM（溶菌酶），内毒素含量分析结果显示，含量均为M组>Z组>H组，可推测内毒素经肠道渗透进入血液引起内毒素血症，进而导致炎症发生。
3、小鼠与奶牛肠道菌群宏基因组学分析
（1）通过对小鼠与奶牛肠道菌群宏基因组学分析表明，H组小鼠与健康奶牛乳杆菌的相对含量较高，而M组与Z组小鼠及乳房炎奶牛拟杆菌相对含量较高。
（2）香农指数、辛普森指数、chao1指数均体现出健康奶牛与H组小鼠肠道菌群α多样性较高。
（3）通过OTU水平的PCoA与属水平PCA分析，Meta-Storms相似性距离统计分析后判定β多样性具有显著性差别，健康奶牛菌群移与H组小鼠菌群结构更为相似，证明健康奶牛肠道菌群更为稳定。
（4）H组小鼠肠道中发酵产生乙酸、丁酸与琥珀酸的粪球菌属C oprococcus、瘤胃球菌属Ruminococcus、Anaerostipes以及乳杆菌属Lactobacillus相对含量较高的，而拟杆菌属Bacteroides与梭菌属Clostridium的含量低于乳房炎奶牛组与移植其粪便的两组小鼠，产酸菌属维持肠道低pH的内环境，与乳杆菌属Lactobacillus互利共生，酸性环境抑制了致病菌的繁殖。
4、结论
乳房炎奶牛与健康奶牛肠道菌群结构与功能均有显著差异。（1）健康奶牛肠道菌群结构稳定，对环境外压的抵抗力强；（2）产酸菌与乳杆菌丰度较高，可降低肠道内的PH值，抑制致病菌增殖；（3）乙酸、丁酸为机体供能的同时还可修复肠膜损伤；（4）移植健康奶牛粪便小鼠肠道菌群能量代谢系统更为活跃，证明健康的肠道菌群可加强宿主与外界的物质能量交换，增强宿主体质，维持宿主健康稳态，进而预防乳房炎的发生。总之，益生菌可增强肠道菌群的活力与能量代谢系统，提高肠道菌群的功能基因多样性，提高产酸菌丰度，增强机体免疫应答，维护肠黏膜屏障作用，对乳房炎具有良好的防治效果。
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