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内农大&内蒙古人民医院: 特定复合益生菌联合二甲双胍可提高对2型糖尿病的疗效

时间:2023-08-12 来源:实验室 作者:九卿臣 浏览次数:7350

导读


二甲双胍是治疗2型糖尿病的常用药物,但其会引起胃肠道的不良反应,特别是在长期治疗后。因此,找出一种能够协同二甲双胍疗效,同时减轻不良反应的辅助治疗方式有重要意义。先前研究发现肠道菌群是二甲双胍的靶标,因此本研究通过进行为期3个月的随机、双盲、安慰剂对照临床试验,探讨益生菌联合二甲双胍治疗2型糖尿病的有益效果和潜在机制。临床结果显示,与单独服用二甲双胍相比,益生菌与二甲双胍联合使用显著降低了糖化血红蛋白水平(P<0.05)。宏基因组学和代谢组学分析表明,益生菌的共同使用增加了肠道短链脂肪酸(SCFA)产生菌和胆汁酸的丰度,干预后益生菌组的胆汁酸和相关代谢物显著或略高于安慰剂组。综上所述,本研究结果显示,益生菌与二甲双胍联合使用可协同对2型糖尿病患者的降糖作用,其可能是通过调节肠道菌群,进而调节SCFA和胆汁酸代谢发挥作用的。本文研究结果支持益生菌和二甲双胍联合治疗对2型糖尿病患者有益。


论文ID


原名:Adjunctive Probio-X Treatment Enhances the Therapeutic Effect of a Conventional Drug in Managing Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Short-Chain Fatty Acid-Producing Bacteria and Bile Acid Pathways

译名:Probio-X通过促进短链脂肪酸产生菌和胆汁酸途径增强常规药物在2型糖尿病中的疗效

期刊:mSystems

IF:6.4

发表时间:2023.1

通讯作者:张和平,李冬梅

通讯作者单位:内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室;内蒙古自治区人民医院

DOI号:10.1128/msystems.01300-22


实验设计


本研究采用了为期3个月的随机、双盲、对照试验,该临床试验分为两个阶段进行,共招募了58例经临床诊断为T2DM的患者,受试者被随机分配到益生菌组或安慰剂组(每组n=29)。益生菌组接受Probio-X (3×1010 CFU/d,2 g/d,晚餐后服用)和二甲双胍(0.75-1.5 g/d,三餐前服用),而安慰剂组接受安慰剂粉(麦芽糊精,2 g/d,晚餐后服用)和二甲双胍(0.75-1.5 g/d,三餐前服用)。所有患者每4周就诊一次,每次就诊时记录体重和腰围,在试验开始(第0个月)和结束(第3个月)采集血液和粪便样本,监测患者空腹血糖、糖化血红蛋白、糖耐量和胰岛功能,并对血脂、尿酸和胆汁酸水平进行测定。从粪便样本中提取宏基因组DNA,在Illumina NovaSeq平台上对所有样本进行宏基因组测序,并使用LC-MS测定粪便代谢物,同时监测相关临床参数、粪便微生物组和代谢组的变化。


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图1 实验设计图

前言


2型糖尿病(T2DM)是一种以血糖水平升高为特征的慢性代谢内分泌疾病,糖尿病的典型症状是“三多一少”,即多尿、多饮、多食和体重减轻。在过去的几十年里,现代生活方式的改变大大增加了患者数量,目前全球有超过5亿的糖尿病患者。糖尿病通常伴有一系列严重危害人类健康的并发症,如糖尿病肾病和心脑血管疾病等。目前双胍类药物、α-葡萄糖苷酶抑制剂和胰岛素促泌剂常用于糖尿病治疗,二甲双胍是治疗2型糖尿病最常用的药物,但其特异性降血糖机制尚不清楚。一般认为,二甲双胍主要通过抑制线粒体呼吸复合物I、增加AMP水平和激活AMP活化蛋白激酶来发挥降糖作用。然而,越来越多的研究表明,肠道微生物可能在二甲双胍的降血糖机制中发挥重要作用,例如以往的研究表明,T2DM患者肠道菌群的α多样性普遍低于健康个体,厚壁菌门和放线菌门的相对丰度增加,而拟杆菌门的相对丰度降低。二甲双胍降低T2DM患者的血糖,同时伴随着肠道微生物的显著变化,包括脆弱拟杆菌丰度的显著降低,这表明肠道菌群在降低血糖方面发挥了作用。现有证据支持肠道菌群通过调节胆汁酸(BAs)来调节代谢性疾病,胆汁酸及其代谢物是重要的生物活性配体,与肠道受体相互作用以调节代谢。最近的一项体内外联合研究表明,二甲双胍可以通过降低脆弱拟杆菌的肠道水平来改善高血糖等代谢紊乱,从而增加特异性BAs,抑制肠道法尼醇X受体信号,增加胰高血糖素样肽1(GLP-1),并改善血糖稳态。这些研究一致支持二甲双胍靶向BA调节肠道菌群影响T2DM的临床表现。


在临床情况下,糖尿病患者会根据高血糖的严重程度和症状管理的目标,采用单一或联合方案进行治疗。然而,糖尿病药物不可避免地会引起一些副作用或不适,例如二甲双胍可能引起恶心、胀气、腹胀、腹泻、维生素B12缺乏和胃不适,而利拉鲁肽可能引起恶心、腹泻、呕吐、食欲下降、消化不良和便秘。二甲双胍通常是治疗2型糖尿病的首选药物,与利拉鲁肽等其他药物联合使用可提供额外的治疗效果。因此,在开出联合方案时考虑不良反应是非常重要的,探索提高二甲双胍临床疗效而且副作用最小的治疗方法是非常有意义的。


益生菌被定义为活的微生物,当给予足够的数量时,会给宿主带来益处。在一些动物和人类随机对照试验(RCT)中,益生菌已被证明可以改善2型糖尿病的临床指标。先前研究表明,合生元可以显著降低饮食诱导肥胖小鼠的体重、血糖、血脂和其他临床指标,补充多株益生菌可以降低2型糖尿病患者空腹血糖、糖化血红蛋白水平和胰岛素抵抗指数。对9项RCT进行meta分析发现,与传统酸奶相比,益生菌酸奶并没有显著改善患者的空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗等T2DM或肥胖指标。尽管许多研究表明,益生菌和相关产品对缓解2型糖尿病有益,但由于不同研究和不同个体之间的临床效果差异,目前尚未明确规定如何在临床情况下使用这些治疗方法,特别是菌株、剂量和干预时间的不同可能导致多种因素的结果差异。因此,仍需要大规模、高质量的临床试验来探索潜在的降糖候选菌株。


益生菌产品Probio-X包括5种不同的益生菌菌株:Lactobacillus casei Zhang、Lactobacillus plantarum P-8、Lactobacillus rhamnosus Probio-M9、Bifidobacterium animalis subsp. lactis M8 (Probio-M8)和Bifidobacterium animalis subsp. lactis V9。先前的临床研究表明了这些菌株的各种有益作用,例如Lactobacillus casei  Zhang可以减少脂肪积累和中心型肥胖,Bifidobacterium animalis subsp. lactis V9可与肠道激素相互作用,通过肠-脑轴影响垂体-下丘脑内性激素的分泌,从而缓解多囊卵巢综合征,Lactobacillus plantarum P-8可降低炎症因子水平,改善认知能力。Lactobacillus rhamnosus Probio-M9对肿瘤防治有良好的疗效,Probio-M8可降低氧化三甲胺的水平,改善冠心病的相关症状。Probio-X含有这五种益生菌,并已被用于许多临床试验,先前的研究表明,Probio-X通过调节脂质代谢维持肠道菌群稳态缓解高脂血症。我们之前的研究发现,Probio-M8可以减轻高血糖小鼠模型的T2DM症状,因此本试验选择了复合益生菌产品Probio-X。


鉴于先前证实的2型糖尿病症状缓解效果,我们设计了3个月的随机对照试验来研究二甲双胍和益生菌联合治疗2型糖尿病患者的协同效应。主要结果是2型糖尿病的多项临床指标,包括空腹血糖、糖化血红蛋白、糖耐量和胰岛功能,并在干预前后分别监测了患者的粪便宏基因组和代谢组的变化。本研究的第二个目的是对患者肠道菌群、临床指标和代谢物的变化进行生物信息学分析,揭示联合方案改善T2DM的潜在降血糖机制,这将是制定使用益生菌作为常规药物治疗2型糖尿病辅助治疗临床指南的重要一步。


结果


1 人口统计数据


共纳入58例T2DM患者,包括第一期(n=10)和第二期(n=48),只有48例患者完成了临床试验(益生菌组:n=27;安慰剂组:n=21)(图2A)。受试者年龄分别为48.70±11.11岁(益生菌组)和46.90±11.25岁(安慰剂组)。两组间基线年龄、体重、腰围差异均无统计学意义(P=0.60,P=0.44,P=0.16)(表S1)。所有患者均接受二甲双胍(盐酸二甲双胍缓释片)(0.75-1.5 g/d,分三次服用)(表S1),并相应地使用2 g安慰剂材料或益生菌。在第一阶段,仅采集空腹血糖、糖化血红蛋白、尿酸和粪便宏基因组样本,没有对第一期患者的粪便代谢进行分析。在第二阶段,有10个个体(分别来自益生菌组和安慰剂组的2个和8个个体)未能进行随访,其中1个个体的样本不足。因此,本研究只对来自37个个体的样本进行了粪便代谢分析(益生菌组:n=20;安慰剂组:n=17)(图2A)。

2 联合使用益生菌可降低血糖和糖化血红蛋白,但不能提高尿酸和血脂水平


空腹血糖、糖化血红蛋白和尿酸是诊断糖尿病的重要指标。本研究结果显示,Probio-X与二甲双胍联合干预3个月显著降低了糖化血红蛋白水平(P<0.05),而安慰剂组没有观察到显著变化(图2B),并且益生菌组受试者的空腹血糖水平呈下降趋势。高水平的尿酸通常会增加糖尿病患者发生肾病的风险,益生菌组在3个月干预后无明显下降(图2B),而安慰剂组虽然在组间和时间点无显著差异,但尿酸水平呈相反的趋势。我们监测了所有患者的4项血脂指标:甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和总胆固醇(CHOL),但两组间的血脂指标差异无统计学意义(表S2)。这些结果表明,与单独服用二甲双胍相比,Probio-X和二甲双胍联合使用可显著增强降血糖作用,且降血糖作用与监测的血脂指标无关。

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图2 2型糖尿病的实验设计及临床指标。(A)临床试验工作流程图。GLU,葡萄糖。(B)在干预前(0M)和3个月干预后(3M),益生菌(Pro)和安慰剂(Pla)组空腹血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)和血尿酸(UA)水平的变化。采用Wilcoxon检验和t检验来评估益生菌组和安慰剂组在同一时间点的水平差异,以及同一组在第0个月和第3个月之间的纵向差异。给出了由成对比较产生的P值。(原文图1)


3 联合使用益生菌可增强胰岛素分泌,改善胰岛功能


口服葡萄糖耐量试验(OGTT)是一种葡萄糖压力测试,它表示胰岛功能和身体调节血糖的能力。各组间及时间点间血糖和胰岛素曲线下面积均无明显差异(图3A和B)。干预3个月后,益生菌组的β细胞功能指数显著升高(P=0.03)(图3C),但胰岛素抵抗指数和胰岛素敏感性指数无显著差异(图3D和E;表S3)。结果表明,Probio-X可以增加胰岛素分泌,改善胰岛功能。

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图3 葡萄糖耐量和胰岛功能评估。(A、B)血糖(A)和胰岛素(B)曲线下面积的差异。(C)稳态模型评估(HOMA-β)。(D)稳态模型评估-胰岛素抵抗(HOMA-IR)。(E)干预前(0M)和3个月干预后(3M)益生菌组(Pro)和安慰剂组(Pla)的定量胰岛素敏感性检查指数(QUICKI)和Gutt指数。P值由两两比较产生(Wilcoxon检验)。(原文图2)


4 益生菌可调节粪便菌群组成,但不影响整体菌群多样性


本研究分析了基线和第3个月的96个粪便样本(n=48)的宏基因组(表S4)。在大多数情况下,α多样性没有显著差异(反映在Shannon和Simpson多样性指数上,除了第3个月益生菌组和安慰剂组之间的Simpson多样性指数[P=0.05])(图4A)。采用主坐标分析法(PCoA)分析β多样性(图4B),代表四个亚组的符号在PCoA评分图上有高度的重叠,表明各组与时间点之间的肠道菌群结构和组成有很大的共性,但相似性分析(ANOSIM)无显著差异(表S5)。


接下来,在更精细的分类水平上分析了干预后肠道菌群组成的变化,识别出物种水平基因组箱(SGBs)(两组之间在第0天没有显著差异,但仅在干预后时间点或不同处理之间有显著差异)。在每组中都发现了一个在3个月和基线之间差异丰富的反应性SGB:益生菌组的Faecalibacterium prausnitzii增加,安慰剂组的Fusicatenibacter saccharivorans减少。在第3个月,两组之间检测到6个差异富集的SGB:与益生菌组相比,安慰剂组Fusicatenibacter saccharivoransRuminococcus bromii显著富集,而益生菌组中Eubacterium sp. strain CAG:274、Bifidobacterium longumButyricicoccus sp.显著富集(图4C;表S6)。一些产生短链脂肪酸(SCFA)的细菌,如Faecalibacterium prausnitziiBifidobacterium longum在益生菌组中显著富集(图4C)。

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图4 各组间的微生物多样性和差异丰富的物种水平基因组箱(SGBs)。安慰剂组(Pla)和益生菌组(Pro)组在第0个月(0M)和3个月(3M)干预后肠道菌群的(A) Shannon和Simpson多样性指数。四个亚组的(B)坐标分析(PCoA)评分图。代表每个亚组的符号以不同的颜色显示。(C)益生菌组和安慰剂组在不同时间点的SGB有显著差异。P<0.05认为有统计学意义。(原文图3)


5 益生菌可调节一些粪便代谢物和血清BAs


采用基于非靶向液相色谱-质谱(LC-MS)的代谢组学分析目标粪便代谢物。数据采用无监督坐标法、主成分分析法(PCA)进行分析,代表质量控制(QC)样品的符号紧密聚类(图5A),表明分析仪器和条件稳定,生成数据可靠。通过火山图分析差异代谢物(图5B),在第3个月发现益生菌组和安慰剂组之间有40个差异代谢物。通过与数据库比对后将所有40种差异代谢物注释到相应的化合物中,基于40个差异代谢物的代谢途径分析表明,益生菌组和安慰剂组之间的差异主要属于氨基酸代谢途径(色氨酸代谢、组氨酸代谢及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成)和一些脂肪酸代谢途径(如鞘脂代谢)(图5C)。

在第3个月,一些代谢物的信号强度显著(5-羟色氨酸、皮质醇、D-色氨醇、鹅去氧胆酸和猪去氧胆酸[P<0.05])或轻微(鞘氨醇和胆酸[P=0.05])(图5D和表S7)强于安慰剂组,而三氯蔗糖则呈现出相反的趋势(P<0.05)(图5D)。其中一些物质(特别是胆酸、猪去氧胆酸和鞘氨醇)在初级胆汁酸的生物合成和鞘脂代谢途径中发挥重要作用。为了进一步研究受试者的BA代谢,采用LC-MS分析其血清BA水平,干预后其成分无显著变化(图S1)。

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图5 粪便代谢组的变化。(A)益生菌(Pro)和安慰剂(Pla)组在干预前后的主成分分析(PCA)评分图。“QC”代表质量控制样品。来自不同亚组的样本以不同的颜色显示。(B)火山图显示益生菌组和安慰剂组在3个月时的代谢物差异。代谢产物显著增加(倍数变化>2,P<0.05),代谢产物显著减少(倍数变化<0.5,P<0.05)。(C)基于差异丰富代谢物的代谢途径富集分析。(D)箱线图显示了糖尿病患者对益生菌干预敏感的相关粪便代谢物。共有37例患者在两个连续时间点提供粪便样本进行代谢组学分析(益生菌组n=20;安慰剂组n=17)。采用Wilcoxon检验或t检验评估统计学差异,P<0.05认为有统计学意义。(原文图4)


讨论


肠道菌群失调与2型糖尿病、高血压、高脂血症等各种代谢性疾病的发生有关。二甲双胍是治疗2型糖尿病的一种常见的降糖药物,多项研究的结果支持肠道微生物可能是二甲双胍的靶点之一。益生菌已被证明可以减轻肠道菌群生态失调,而食用益生菌已被认为是治疗2型糖尿病的一种新型辅助治疗方法。因此,本文研究了益生菌与二甲双胍联合使用对治疗2型糖尿病的额外益处。结果显示,与单独服用二甲双胍相比,联合方案显著提高了降血糖效果,但不能显著降低Ⅱ型糖尿病患者的尿酸水平。因此,益生菌与二甲双胍的联合干预协同改善了一些T2DM的相关临床参数。

胰岛素抵抗是一种病理状态,细胞对胰岛素失去反应,胰腺发出信号分泌更多胰岛素以降低血糖,最终这些细胞变得更加抵抗胰岛素,导致胰岛素和血糖水平升高。本研究结果表明,益生菌能显著改善胰岛素β细胞的功能指数,但两组间胰岛素抵抗和胰岛素敏感性水平无显著差异。稳态模型评估-胰岛素抵抗(HOMA-IR)指数是胰岛素抵抗最常见的临床指标,但其对动态胰岛素分泌的反应有限,因此我们也使用了Gutt指数和QUICKI,得到了一致的结果。当前的研究结果显示,Probio-X与二甲双胍联合使用改善了一些T2DM相关指标,尽管益生菌组和安慰剂组之间的胰岛素抵抗没有明显的变化。
先前研究发现,二甲双胍的降血糖作用通过口服比静脉注射摄入明显,表明二甲双胍的作用机制与胃肠道直接相关。基于先前的研究报道,我们假设肠道菌群是二甲双胍降低血糖作用的主要靶点之一,二甲双胍可能在调节肠道菌群及其代谢物的结构中发挥作用,从而影响宿主的生理功能,受试者肠道菌群的基线组成也可作为二甲双胍治疗的短期疗效和药物耐受性的预测工具。因此,本研究也从粪便宏基因组学和代谢组学的角度分析了二甲双胍降血糖作用的潜在机制和途径。
数据显示干预后益生菌组的Simpson指数显著高于安慰剂组。一般来说,菌群多样性的减少被认为是一种不健康的状态,因为它代表了肠道内稳态状态的中断,这通常是由于抗生素和药物干扰等外部因素造成的。肠道菌群的紊乱往往会影响宿主的正常代谢和免疫力,在临床情况下,肠道微生物的α多样性减少常见于各种慢性疾病中,如帕金森病和肠易激综合征。另一方面,PCoA并没有显示出肠道菌群结构的剧烈变化,这表明二甲双胍添加或不添加益生菌的治疗效果并不是由于肠道菌群结构或组成的变化引起的。
为了确定肠道菌群中可能与症状改善相关的变化,我们分析了反应性SGB的变化。一些与SCFA产生相关的SGB丰度在益生菌干预后显著增加,之前的一项研究分析了952名志愿者的粪便SCFA(包括乙酸、丙酸和丁酸)代谢组学数据,发现肠道短链脂肪酸(特别是丁酸)的增加对胰岛素反应、能量平衡和代谢稳态有很大的有益影响,但丙酸代谢的异常可能会增加糖尿病发展的风险,这支持了肠道菌群对代谢特征和2型糖尿病的风险存在因果影响。另一项在非肥胖糖尿病小鼠中进行的研究发现,SCFAs可以预防自身免疫性胰岛素炎,并减缓糖尿病的发展。一些产生乙酸盐和丁酸盐的细菌丰度和多样性与T2DM的临床效果显著相关,乙酸盐产量的增加可以促进GLP-1和PYY的分泌,从而改善血糖。因此,SCFA产生菌丰度的增加可能会改善宿主的葡萄糖代谢,这在糖尿病患者中尤为重要。
益生菌组与安慰剂组之间的代谢产物差异主要与色氨酸代谢、初级BA生物合成和鞘脂代谢等途径有关。在3个月的干预后,益生菌组中一些BAs、鹅去氧胆酸和猪去氧胆酸的粪便含量显著高于安慰剂组。鹅去氧胆酸和猪去氧胆酸是相关的化合物,因为鹅去氧胆酸可以通过CYP3A4酶的作用转化为猪胆酸。BAs可以作为信号分子来调节葡萄糖、脂质和能量的代谢,猪胆被广泛用于中药治疗糖尿病,猪胆酸是其改善血糖稳态的活性成分。事实上,猪去氧胆酸是猪胆酸的组成部分之一,两者的合成前体都是由替代途径产生的胆汁酸。猪胆酸通过激活TGR5信号通路,抑制法尼醇X受体信号通路,上调胰高血糖素原的表达,从而促进GLP-1的产生和分泌。因此,我们观察到益生菌干预后粪便中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸水平升高,这也可能是本研究参与者临床症状缓解的部分机制。

综上所述,通过宏基因组学和代谢组学分析,本研究结果支持益生菌和二甲双胍的联合治疗对T2D患者有益。其可能通过两种特定途径改善2型糖尿病患者的临床症状(图6):(1)促进肠道中短链脂肪酸产生菌的丰度,从而调节结肠短链脂肪酸的含量,进而促进GLP-1的分泌。(2)增加特异性胆汁酸水平,从而激活G蛋白偶联受体和法尼醇受体,最终促进GLP-1分泌。GLP-1是一种胃肠道激素,它也与二甲双胍一起作用于循环系统,以降低血糖水平。然而,本研究提出的模型还需要进一步的验证。此外,从试验开始到结束,受试者的流失有明显的差异,安慰剂组有更多的人退出,这可能导致结果偏差。因此,本研究中得出的结论需要仔细解释。


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图6 临床症状改善机制示意图。所示是血糖代谢和益生菌驱动宿主反应的调节关键途径的示意图。SCFA,短链脂肪酸;TGR5,G蛋白偶联胆汁酸受体1;FXR,法尼醇X受体;ASBT,顶端钠依赖性胆汁酸转运体;PYY,肽YY;GLP-1,胰高血糖素样肽1。(原文图5)


原文链接:https://journals.asm.org/doi/full/10.1128/msystems.01300-22


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