内蒙古农大: 基于非靶向质谱的代谢组学方法揭示益生菌发酵乳在发酵过程中的生化变化(国人佳作)

时间：2023-06-12 来源：实验室作者：九卿臣浏览次数：8105

导读

益生菌功能产品因其日益普及而受到广泛关注，然而很少有研究分析发酵过程中的益生菌特异性代谢。本研究应用基于UPLC-QE-MS的代谢组学，追踪副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)PC-01和青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)B8589发酵过程中牛乳代谢组的变化。在发酵0-36 h之间，益生菌发酵乳代谢组发生了显著变化，而在发酵中期(36 h和60 h)和成熟期(60 h和72 h)的差异不明显。鉴定到9种与发酵时间有关的特异性差异代谢物，主要属于有机酸、氨基酸和脂肪酸，参与了三羧酸循环、谷氨酸代谢和脂肪酸代谢。另外，丙酮酸、γ-氨基丁酸和癸酸的含量增加，有助于提高益生菌发酵乳的营养品质和功能特性。这项贯穿完整发酵过程的代谢组学研究分析了牛乳中益生菌发酵变化，提供了乳基质中益生菌代谢的详细信息和益生菌发酵乳的潜在有益机制。

论文ID

原名：Untargeted mass spectrometry-based metabolomics approach unveils biochemical changes in compound probiotic fermented milk during fermentation

译名：基于非靶向质谱的代谢组学方法揭示复合益生菌发酵乳在发酵过程中的生化变化

期刊：npj Science of Food

IF：7.0

发表时间：2023.5

通讯作者：王记成

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI号：10.1038/s41538-023-00197-z

实验设计

将含2%葡萄糖的脱脂乳粉溶解在蒸馏水中(50°C，30 min)，均质后巴氏杀菌(95°C，5 min)，然后冷却至20°C。采用菌株B8589和PC-01进行复合发酵，将益生菌接种到冷却的巴氏杀菌脱脂牛奶中，PC-01和B8589的初始活菌计数分别调整为1×10⁷ CFU/mL和1×10⁶CFU/mL。接种的牛奶在37°C下厌氧发酵，直到72 h后pH值达到3.8。在pH达到3.8后，益生菌发酵乳在−80°C下保存，直到进一步分析。在发酵过程中，每12 h采集一次发酵乳样品，使用流式细胞仪对活益生菌计数，采用超高效液相色谱法检测牛乳代谢组(0、36、60和72 h)，以监测牛乳发酵过程中代谢物和代谢途径的变化，并对已鉴定的差异代谢途径进行富集分析。

前言

发酵是一种代谢过程，其中有机物在酶的作用下被完全分解。发酵乳是最重要的发酵食品之一，被公认为是健康食品和益生菌的良好载体。益生菌广泛分布于肠道、口腔、女性生殖道以及皮肤黏膜层，越来越多的证据表明，益生菌发酵乳给消费者带来了各种健康益处，如降低血清胆固醇、增强免疫反应、改善肠道健康、预防各种癌症和减轻认知障碍。这些作用可归因于益生菌发酵乳中的各种功能成分，如多肽、多糖、脂肪酸、有机酸、维生素和γ-氨基丁酸(GABA)。副干酪乳酪杆菌广泛应用于益生菌食品工业，不仅对胃肠道健康和宿主免疫有益，其在缓解牙周炎和龋齿等口腔疾病方面也有临床疗效。更重要的是，一些副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)菌株具有良好的发酵特性，可用于食品发酵。另一株有益菌是双歧杆菌，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)是人类肠道菌群的重要组成部分，与宿主的健康有关，如保持健康的体重和防止便秘，但其活力较低，很难用于发酵。因此，将青春双歧杆菌与其它发酵性能良好的菌株进行复合发酵是提高其益生菌活力的一种选择。

以往的一些研究已经调查了益生菌发酵乳代谢组的变化，但大多数研究并没有集中于分析益生菌在发酵过程中的特异性功能和代谢。嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)是最常见的基本发酵剂，然而这些传统发酵剂与益生菌在发酵过程中的联合使用，导致益生菌特有的生化效应和代谢作用很难区分，因此研究益生菌对牛乳代谢组的单一影响为了解益生菌特异性代谢提供见解。此外，即使在发酵结束后，由于活菌持续的生理作用，益生菌产品的乳代谢组也可能会发生成熟变化，这在益生菌产品中尤为重要，因为益生菌在发酵过程中和发酵后的活力对其有至关重要的作用。然而，以往的研究通常只分析成熟过程的变化，而不关注监测牛乳发酵过程中代谢物的变化，这种变化也反映了产品的质量和稳定性。

本研究使用副干酪乳酪杆菌PC-01(PC-01)和青春双歧杆菌B8589(B8589)共同发酵。从天然发酵的牦牛乳中分离得到的PC-01菌株具有良好的发酵特性和益生菌特性，已成功应用于发酵乳的生产，另一株从健康婴儿肠道中分离出来的B8589具有良好的抗炎效果和肠道菌群调节作用。此外，先前研究发现，与单独使用PC-01菌株相比，PC-01和B8589联合发酵显著提高了发酵乳中GABA和短链脂肪酸的水平。因此，本研究旨在进一步探究两株菌株作为发酵剂在共发酵和发酵成熟过程中的代谢组学变化，分别用流式细胞仪和非靶向代谢组学监测活菌计数和牛乳代谢组学的变化(图1)。

图1 研究设计示意图。巴氏杀菌乳由青春双歧杆菌B8589和副干酪乳酪杆菌PC-01共同发酵。每发酵12 h采集一次样品，直到72 h后pH值达到3.8。使用流式细胞仪测定发酵乳中益生菌活菌数。采用超高效液相色谱法检测牛乳代谢组(0、36、60和72h)，以监测牛乳发酵过程中代谢物和代谢途径的变化，并对已鉴定的差异代谢途径进行富集分析。

结果

1 益生菌发酵乳中活细胞计数的变化

使用流式细胞仪检测不同发酵时间点益生菌发酵乳的活细胞计数(图2A)。活细胞计数在发酵36 h时达到峰值(1.57×10¹⁰ CFU/mL)，显著高于发酵0 h时的数量(8.49×10⁷CFU/mL；P<0.001)。在60 h时显著下降到8.87×10⁹CFU/mL(P<0.001)，并在72 h时显著上升到1.57×10¹⁰ CFU/mL(P<0.001)。

图2 发酵乳中益生菌活力和乳代谢组的变化。(A)益生菌发酵乳中活细胞计数的变化。误差条表示平均值±标准差。***P<0.001。在95%显著性水平(P<0.05)下，采用方差分析法评估不同时间点间微生物活菌计数的差异。(B)在发酵的不同时间点(0、36、60、72 h)，牛乳代谢组的主成分分析图。QC质量控制样品。

2 复合益生菌发酵乳在不同发酵阶段的代谢足迹

对0、36、60和72 h采集的益生菌发酵乳样品进行了非靶向代谢组学研究(基于UPLC-QE-MS)。为了提高可解释性并验证我们的数据，进行了主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)来可视化不同时间点乳代谢组的变化。主成分分析反映了样本之间的整体变异性，x轴和y轴分别表示样本在由第一和第二主成分组成的平面上的投影得分，可以为样本之间的相似性或差异性提供参考。代表0、36、60和72 h样品的符号显示出明显基于时间的聚类趋势，质量控制样品也紧密聚集为一组(图2B)，表明乳代谢组整体结构在不同时间点之间存在变化，设备和色谱条件稳定可靠。

使用OPLS-DA模型来识别不同时间点之间的差异标记代谢物(0 h vs 36 h；36 h vs 60 h；60 h vs 72 h)，过滤掉与代谢物分类变量无关的正交变量，对非正交变量和正交变量分别进行分析，从而获得更可靠的组间差异代谢物。OPLS-DA模型的得分图如图3A-C所示。同样，在每一个两两比较中都可以观察到清晰的基于时间的聚类趋势。此外，各组的模型参数证实了模型的有效性和准确性(0 h vs 36 h：R²Y=0.999，Q²=0.997；36 h vs 60 h：R²Y=0.992，Q²=0.983；60 h vs 72 h：R²Y=0.994，Q²=0.988)。

图3 益生菌发酵乳在发酵过程中代谢组谱的时间过程变化。发酵乳样品的(A-C)正交偏最小二乘法判别分析得分图和(D-F)火山图。(A, D) 0 h vs 36 h；(B, E) 36 h vs 60 h；(C, F) 60 h vs 72 h。火山图显示了牛乳代谢组学数据。每个点代表一个被检测到的代谢物。样品间两两比较发现显著增加(Sig_Up)和减少(Sig_Down)的代谢物分别用红色和蓝色表示(临界值P<0.05和倍数变化[FC]>2或<0.5)。显著的阈值用火山图中的黑色虚线标记。在95%显著性水平(P<0.05)下，采用方差分析法评估不同时间点之间的差异代谢物。

3 差异标记代谢物的鉴定

检测到的代谢物在火山图中可视化(图3D-F)，差异标记代谢物的临界阈值分别为倍数变化˃2或<0.05和P<0.05。共确定304种差异代谢物(36h vs 0h，151种增加和153种减少)，其中244种通过数据库检索确定(补充表1)，包括66种脂类和类脂分子、59种有机酸及其衍生物、43种有机氧化合物、31种有机杂环化合物、13种苯丙素和聚酮、15种苯类和17种其他代谢物。在36 h和60 h的益生菌乳代谢组之间鉴定出110种差异代谢物(与36 h相比，60 h时43种增加和67种减少)，通过数据库检索，确定了其中79种差异代谢物(补充表1)，包括21种有机氧化合物、20种有机酸及其衍生物、17种有机杂环化合物、9种脂类和类脂分子和12种其他代谢物。在60 h和72 h之间鉴定出36种差异代谢物(与60 h相比，72 h时24种增加12种减少)，其中27种差异代谢物通过数据库搜索确定(表S1)，包括7种脂质和类脂分子、9种有机氧化合物、5种有机酸及其衍生物以及6种其他代谢物。

根据化学性质对关键的差异代谢物进行排序，以进一步了解益生菌发酵乳在生产中的生化过程(图4)。差异代谢物主要为脂类和类脂分子、有机酸及其衍生物、有机氧化合物和有机杂环化合物，其次是苯丙类和聚酮类、苯类、生物碱及其衍生物等。显然，在不同时间点(0 h vs 36 h；36 h vs 6 0h；60 h vs 72 h)之间发现了不同的差异代谢谱(包括代谢物多样性和丰度)。为了进一步研究牛乳发酵不同阶段的生化变化，我们选择性地对3种主要代谢物(即脂类和类脂分子、有机酸及其衍生物、有机氧化合物)进行了代谢途径富集分析。

图4 在不同时间点采集的益生菌发酵乳样品之间鉴定的差异代谢物类型。粉色、绿色和蓝色的水平条分别代表在0 h vs 36 h、36 h vs 60 h、60 h vs 72 h之间识别的差异代谢物的数量。

4 代谢途径富集分析

代谢物途径富集分析是阐明样品代谢改变机制的有效工具。从0到36 h，鉴定出25种有机酸及其衍生物相关的代谢途径，涉及17种不同的代谢物(主要是氨基酸和有机酸；图5A和表S2)。富集了10种脂类和类脂分子相关的代谢途径，涉及9种不同的代谢物(主要是脂肪酸和甘油磷脂；图5B和表S2)，鉴定出10种与有机氧化合物相关的代谢途径，涉及13种不同的代谢物(主要为碳水化合物；图5C和表S2)。

从36~60 h，鉴定出17种有机酸及其衍生物相关的代谢途径，涉及6种不同的代谢物(主要是氨基酸和有机酸；图5D和表S2)。3种脂类和类脂分子相关的代谢途径被富集，涉及2种不同的甘油磷脂代谢物(图5E和表S2)，鉴定出7种与有机氧化合物相关的代谢途径，涉及7种不同的代谢物(主要是碳水化合物；图5F和表S2)。

从60~72 h，鉴定出2种有机酸及其衍生物相关的代谢途径，涉及一种有机酸(图5G和表S2)。2种脂类和类脂分子相关代谢途径被富集，涉及2种不同的代谢产物(主要是脂肪酸和胆汁酸；图5H和表S2)，鉴定出6种与有机氧化合物相关的代谢途径，涉及5种不同的代谢物(主要是糖、羰基化合物和醇；图5I和表S2)。

图5 不同发酵时间点间差异代谢途径的富集分析。(A-C) 0 h vs 36 h、(D-F) 36 h vs 60 h、以及(G-I) 60 h vs 72 h之间的比较。富集途径分别与有机酸及其衍生物(A、D、G)、脂类和类脂分子(B、E、H)和有机氧化合物(C、F、I)有关。颜色尺度表示成对样本之间显著性差异(P值)的置信度。采用Wilcoxon秩和检验检测差异代谢途径。

讨论

本研究采用基于LC-MS的代谢组学方法，研究了PC-01和B8589在复杂发酵过程中益生菌发酵乳代谢组不同时间点的代谢变化，通过比较发现了一些显著的差异生物标志物。这些代谢物主要是有机酸、氨基酸和脂肪酸，它们参与了三羧酸(TCA)循环、脂肪酸代谢、谷氨酸代谢等重要的代谢途径(图6)。这些代谢物及其参与的代谢途径不仅影响益生菌的生长和繁殖，还影响发酵乳的风味和益生菌特性，复杂的代谢途径通过产生代谢物的反馈机制相互促进或抑制。目前发现的一些代谢物相互作用及其相关代谢途径在牛乳发酵中的特定作用之前尚未报道，值得进一步研究。9种特定发酵阶段的代谢物(琥珀酸、丙酮酸、L-谷氨酸、富马酸、GABA、癸酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸)显著促进了代谢的差异富集(图6)，这些代谢物在发酵乳中普遍存在，对其质量和感官特性至关重要。

图6 由9种鉴定的差异代谢物及其相对丰度构建代谢图谱。9种代谢物(即丙酮酸、琥珀酸、富马酸、L-谷氨酸、GABA、棕榈酸、油酸、硬脂酸和癸酸)在代谢图(左图)中以黑色书写。水平柱状图(右图)显示了这些代谢物在不同采样时间点，即0、36、60和72 h的相对丰度。CoA 辅酶A、GABA γ-氨基丁酸、TCA 三羧酸。

大多数差异代谢物是有机酸，其中最常见的是羧酸(R-COOH)，它们的酸度来自羧基(-COOH)。短链羧酸是影响乳制品风味的重要化学因素，这些酸来源于脂肪分解、碳水化合物代谢和氨基酸代谢，本研究中发现的生物标记短链羧酸是乳酸菌在代谢过程中产生的琥珀酸、丙酮酸和富马酸。

丙酮酸是由葡萄糖被己糖激酶磷酸化后形成的葡萄糖6-磷酸分解得到的，是糖酵解的最终产物，使酸奶具有醋酸的香气和令人愉快的酸味。本研究发现，从0到36 h，丙酮酸显著增加，导致最初丰富的葡萄糖环境和丙酮酸合成代谢高于分解代谢，从而使益生菌在发酵阶段快速增长。随着发酵的结束，葡萄糖被耗尽，更多的丙酮酸转化为其他下游代谢物，延缓了益生菌的生长。丙酮酸也是TCA循环的重要底物-乙酰辅酶A的前体，琥珀酸和富马酸是TCA循环的中间产物，琥珀酸具有酸味、咸味和苦味，是调节细胞氧化应激和炎症反应的线粒体信号分子之一，富马酸是自然界中最简单的不饱和二羧酸，具有果味酸味。琥珀酸可通过琥珀酸脱氢酶氧化为富马酸。与丙酮酸类似，在36 h时，丁二酸含量显著增加，但富马酸含量继续减少，并没有随着丁二酸的积累而增加，这可能意味着益生菌在发酵过程中消耗了富马酸。有些乳酸菌(如罗伊氏乳杆菌和干酪乳酪杆菌)可以利用TCA循环进行还原反应，即还原富马酸形成琥珀酸促进细菌生长。此外，富马酸在正常代谢过程中不会过量积累，它被富马酸水合酶快速催化生成苹果酸，在差异代谢物中也的确检测到了D-苹果酸，但它在36 h与0 h相比没有显著增加，这可能是富马酸持续下降的另一个原因。

氨基酸代谢与TCA循环密切相关，也是氮源代谢的重要产物。L-谷氨酸和α-酮戊二酸通过GABA代谢途径连接氨基酸代谢和TCA循环，GABA的代谢途径是TCA循环的一个分支，是微生物通过谷氨酸脱羧酶直接不可逆地将L-谷氨酸合成GABA的过程。GABA是一种四碳非蛋白氨基酸，具有降血压、抗惊厥作用、镇静神经、改善肝肾、增强机体抗氧化能力、增强运动耐量、增强免疫功能和生殖能力等多种功能。其中一种发酵途径是微生物将谷氨酸转化为GABA，在发酵过程中其含量持续增加，并在发酵结束时达到峰值，与发酵乳的酸化相关。与此同时，GABA也是某些细菌的生长因子，它在某些发酵系统中可促进益生菌的生长。另一方面，高浓度的谷氨酸赋予咸味，并通过发酵转化为GABA，提高了益生菌发酵乳的感官质量。

脂肪酸通常由脂解、蛋白质水解和乳糖发酵等化学过程产生，脂肪酸代谢通过底物乙酰辅酶A与TCA循环相连，不仅能改善产品的味道和质地，而且还能对消费者产生生理影响。发酵乳中主要的不饱和脂肪酸是油酸，占发酵牛乳中总不饱和脂肪酸的70%。油酸可以调节血脂、降低胆固醇以及提高胰岛素敏感性，还能减少危重患者的氧化应激和过度炎症反应。本研究发现，在发酵36 h后，油酸通过加氢转化为硬脂酸使其含量显著下降。硬脂酸水平的增加与降低血压、改善心脏功能和降低癌症风险有关，与人们普遍认为饱和脂肪酸是有害的观点相反，硬脂酸似乎对人类健康有一些有益的影响，尽管这种现象的分子机制目前尚不清楚。在发酵乳中发现的另一种常见脂肪酸是棕榈酸，它通常被认为是不健康的，然而，大多数研究只分析了高剂量棕榈酸的作用，只有一项研究证明了棕榈酸在益生菌发酵乳中具有理想的细胞凋亡和抗癌作用。虽然乳制品是棕榈酸和硬脂酸的重要膳食来源，但它们的摄入量与较低的心脏代谢疾病的风险相关。因此，通过牛乳发酵增加棕榈酸和硬脂酸可能是可取的，但还需要更多的研究来证实这些代谢物对健康的影响。癸酸水平在发酵36 h时显著升高，并一直保持在较高水平，直到发酵结束，癸酸是一种存在于发酵乳中的中链脂肪酸，可以改善癫痫、促进大脑能量代谢以及减轻营养吸收不良综合征。

综上所述，本研究利用UPLC-QE-MS获得了牛乳发酵过程中和发酵后不同时间点益生菌活力和发酵乳代谢组的变化，乳代谢组在较早的时间点(0~36 h)变化较大，在中期(36~60 h)和成熟期(60~72 h)变化差异较小。在益生菌乳发酵的不同阶段发现了许多差异代谢物，主要包括有机酸、氨基酸和脂肪酸，涉及TCA循环、谷氨酸代谢和脂肪酸代谢。9种差异代谢物被鉴定为时间点特异性差异生物标志物，它们的变化可能使益生菌发酵乳具有独特的感官和营养质量。一些功能性生物分子，如丙酮酸、GABA和癸酸，在发酵结束时显著增加，这可能有助于益生菌发酵乳的有益特性。这项贯穿完整发酵过程的代谢组学研究分析了牛奶中益生菌发酵变化，为乳基质中益生菌代谢提供了详细信息。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41538-023-00197-z

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