导读
外太空微生物的研究主要集中在研究在太空中遇到的因素引起的微生物病原体的表型变化。这项研究旨在调查太空暴露对鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9的影响。Probio-M9细胞在一次航天飞行中暴露在太空中。有趣的是，研究结果显示，与原始Probio-M9或未暴露于太空的地面对照菌株相比，相当大比例的太空暴露突变株(35/100)表现出粘稠表型，其特征是菌落更大，并具有产生荚膜多糖(CPS)的能力。在Illumina和PacBio平台上进行的全基因组测序分析显示，CPS基因簇的单核苷酸多态性(12/89，13.5%)分布偏倚，尤其是wze(ywqD)基因。wze基因编码一种假定的酪氨酸蛋白激酶，通过底物磷酸化调节CPS的表达。对两个太空暴露的粘稠突变株的转录组学分析显示，相对于地面对照分离株，wze基因表达增加。最后，我们发现获得性粘稠表型(CPS产生能力)和太空诱导的基因组变化可以稳定遗传。结果证实，wze基因直接影响Probio-M9中CPS的产生能力，太空诱变是诱导益生菌稳定生理变化的潜在策略。
论文ID
原名：The Space Environment Activates Capsular Polysaccharide Production in Lacticaseibacillus rhamnosus Probio-M9 by Mutating the wze (ywqD) Gene
译名：太空环境通过突变wze(ywqD)基因激活鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9的荚膜多糖产生
期刊：Microbiology Spectrum
IF：9.043
发表时间：2023.2.8
通讯作者：刘文俊，刘文君
通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室；华润江中制药集团有限责任公司
DOI号：10.1128/spectrum.04677-22
实验设计
Probio-M9在MRS培养基中37°C传代培养3次，活化的培养物在4°C保存备用。细菌细胞用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤，然后在1.5% MRS琼脂上划线或转移到20%甘油水中，并准备两组重复的Probio-M9培养物作为太空实验和地面对照，太空飞行结束后，四种培养物都在4°C被运送到实验室。改良后从每个太空实验培养物(MRS琼脂和甘油)中选取50个单菌落，从甘油地面对照培养物中选取17个单菌落进行基因组重测序。为了确定细菌克隆之间的基因组水平差异，从100个太空突变株和20个地面对照分离株中提取基因组DNA进行Illumina全基因组测序；进一步利用PacBio SMRT对筛选的10个太空突变株和2个地面对照分离株的基因组进行测序，并染色观察形态特征；将每个分离株的Contigs与原始Probio-M9基因组进行比对，使用MUMmer 3.0识别SNPs；之后测定12株分离株和Probio-M9的CPS。此外，对EPS产量最高的两个太空突变株和一个地面对照分离株进行转录组分析和蛋白质组学分析。并对每个分离株进行遗传稳定性分析。
前言
太空微生物学是对外太空微生物的研究，在世界范围内还处于起步阶段，微生物对太空环境的反应和适应是一个有趣的问题。太空环境具有强辐射、微重力和超真空，使其比其他具有单一突变发生条件的环境更具诱变性。虽然太空环境极端复杂，但微生物普遍具有较高的遗传和表型适应性。因此，将微生物暴露在太空中可以产生具有新颖和理想性质的微生物，空间诱变作为一种新兴的前沿技术近年来受到了广泛关注。
乳酸菌(LAB)广泛存在于自然界和不同的生态位中。许多LAB是已知的益生菌，能够产生各种类型的促进健康的代谢物。例如，许多益生菌可以产生具有营养价值和生物活性的多糖并在食品工业中使用。细菌荚膜多糖(CPS)作为一种重要的细胞表面次生代谢产物，不仅可以增强细胞表面的粘附和生物膜的形成，保护细胞免受极端条件的影响，而且还可以转化为碳或氮源，为支持细胞生存提供能量。益生菌是活的细菌，当摄入足够的量时，对宿主产生有益的影响。因此，益生菌成功的前提是能够在胃肠道运输过程中遇到的恶劣环境中生存。CPS的产生可以提高益生菌在宿主肠道中的生存和定殖能力，增强益生菌在宿主肠道中的粘膜粘附性和对共存肠道微生物的竞争力。由于益生菌衍生的CPS具有抗菌、免疫调节和抗肿瘤特性，因此也具有促进健康的作用。之前的一项研究发现，在高盐度胁迫下，Lactobacillus confusus TISTR的胞外多糖(EPS)产量增加了1.78倍，这表明应激环境可以提高该菌株的EPS产量。因此，探究像太空这样的极端应激诱导的环境是否会引起CPS产生的变化是很有意义的。然而，太空诱变效应在不同的菌株、基因和染色体位置之间是不同的，而且对太空暴露对CPS等细菌代谢物产生的影响知之甚少。鼠李糖乳酪杆菌由于其优于其他物种，已成为应用最广泛的LAB物种之一。鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9是从一名健康女性的母乳样本中分离出来的，具有良好的益生潜力，表现出较高的生长速度和对胆盐和人工胃肠液的强耐受性。Probio-M9已在多个啮齿动物研究中显示出有效的抗肿瘤作用，并在研究队列中显示出减轻压力的效果。本研究探讨了太空暴露对Probio-M9的影响，旨在诱导该菌株发生稳定的生理变化。我们结合生物化学和多组学技术对Probio-M9空间突变体的表型，特别是CPS生成的诱导进行了表征。
结果
1、117株分离株的单核苷酸多态性(SNP)的鉴定
两组平行生长条件下的细胞(在deMan、Rogosa和Sharpe [MRS]琼脂上划线，并浸入20%的甘油中)，其中一组细胞用于太空诱变实验(样本由长征5B火箭送入太空)，而另一组细胞作为地面对照(保存在模拟发射基地，没有太空暴露)。航天飞行后，选取太空突变株和地面对照分离株进行单克隆分析。推测太空环境会诱导大量的点突变，因此我们首先比较了太空突变株和地面对照分离株的SNP谱。共选取117个克隆进行分析(17个来自甘油的地面分离株和50个来自MRS琼脂和甘油的太空突变株)。通过与参考Probio-M9基因组的比较，确定了100个太空突变克隆的SNP谱，在位于89个不同位点的所有分离株中共鉴定出142个SNP。20个突变位点分布在基因间区，69个突变位点分布在编码区(对应18个同义突变，47个非同义突变，4个无义突变)(见补充资料表S2)。与太空突变株相比，在17个地面对照菌株中鉴定出的SNPs(仅位于7个染色体上)要少得多。所分析的太空突变株的平均SNP数为1.70±1.15(每个分离株为0~14个SNP)。HA-R7970-28克隆是在MRS琼脂上粘稠的太空突变株，突变位点数量最多。根据分离株间SNP分布构建系统发育树(图1a)。共鉴定出6个高SNP密度区域(定义为每kb＞3个SNPs的基因组区域)，其中大部分由非同义突变组成。倾斜的SNP分布表明这些基因组区域的编码功能受到强烈的环境选择压力(图1b)。ywqD基因位于SNP数量最多的高SNP密度区域(35个SNP)，仅太空分离株(35/142个SNP，24.6%)发生突变，地面对照分离株均未发生突变。另外四个基因(即gntT、ykoD和两个编码假设蛋白质的基因)在其他高SNP密度区域被预测，其中一个区域是基因间区。gntT基因与高亲和葡萄糖酸盐转运相关，参与葡萄糖相关代谢。ykoD基因编码一种硫胺素导入ATP结合蛋白。太空突变株的突变率明显高于地面对照菌株，证实太空暴露可诱导Probio-M9的点突变。
图1 参考原Probio-M9基因组，对100个太空突变株和17个地面对照株进行SNP分析。(a)基于SNP构建的分离株系统发育树；(b)相对于Probio-M9基因组的SNP分布的直方图。确定了6个高SNP密度区域(定义为每kb＞3个SNPs的基因组区域，由虚线表示)，包括gntT、ykoD、ywqD和两个编码假设蛋白质的基因，导致大多数非同义突变。一个高SNP密度区域位于基因间区。
很大一部分太空突变株的菌落形态发生了改变，其特征是菌落的大小和粘连性普遍增大。为了进一步描述它们的特征，并覆盖一系列表型不同的太空突变株，我们选择了10个(从100个)不同大小和菌落形态的克隆进行后续分析。其中6株(HG-R7970-3、HG-R7970-16、HG-R7970-20、HG-R7970-25、HG-R7970-41和HA-R7970-36)在MRS琼脂上生长时表现出粘稠表型，而其他4株在MRS琼脂上生长时形成非粘稠菌落。粘稠克隆的菌落数量显著大于非粘稠克隆、两个地面对照菌株和Probio-M9(P＜0.05)(图2a)。而非粘稠克隆的菌落直径与地面对照菌株和Probio-M9(P＞0.05)无显著差异。将具有代表性的粘稠太空突变株(HG-R7970-41)的微观形态与具有代表性的地面分离株(SG-R7970-16)和Probio-M9的微观形态进行了比较(图2b)。所有太空突变株和非太空分离株均为革兰氏染色阳性。非粘稠太空突变株(HG-R7970-28、HG-R7970-34、HG-R7970-46、HA-R7970-19)形态与Probio-M9和地面对照菌株相似(短棒，末端规则，形成链；墨汁多糖染色后细胞周围无明显包膜)。相比之下，6个粘稠太空突变株在墨汁荚膜染色后细胞荚膜呈强阳性。扫描电镜分析证实，粘稠突变株细胞外黏液较多，细胞壁较粗糙。
图2 (a)在MRS琼脂上培养48 h后，Probio-M9菌株、太空菌株和地面菌株的菌落大小。粘稠菌株和非粘稠菌株分别用蓝色条和粉色条表示。柱上不同字母表示菌落直径的显著差异(P＜0.05)，误差柱表示标准差。(b) Probio-M9和具有代表性的太空和地面分离株(HG-R7970-41和SG-R7970-16)在MRS琼脂上生长48 h，光照下观察(革兰氏染色和墨汁荚膜染色；100倍率)(左)和电子(1000倍率)(右)显微镜。
接下来，定量了10个太空突变株、2个地面对照菌株和Probio-M9产生的CPS(对应于葡萄糖浓度)。仅在6个粘稠太空突变株中观察到胞外多糖的产生，而在其他分离株或Probio-M9中没有。其中2个粘稠太空突变株HG-R7970-3和HG-R7970-41的CPS产量显著高于其他突变株(33.66 g/L和33.78 g/L vs 23.36 g/L-30.30 g/L；P＜0.05)(图3)。
图3 6个粘稠太空突变株的葡萄糖标准曲线(a)和荚膜多糖浓度(以葡萄糖为测量标准)(b)。突变株间荚膜多糖浓度的统计学差异用柱上不同字母表示(P＜0.05)。
对同样的10个太空突变株和2个地面分离株进行PacBio全基因组测序，以精确绘制其基因组变化。将PacBio测序的基因组与Illumina基因组数据进行校正，以提高基因组作图的准确性。BRIG软件分析显示Probio-M9与测序分离株高度同源(99.99%；GC含量和基因组大小无明显差异)(图4a)。在12株分离株中共发现19个SNP(表1)。有趣的是，6个粘稠太空突变株均在编码CPS基因簇中酪氨酸蛋白激酶的ywqD基因的不同位置出现突变(图4b)，这与Illumina测序的SNP分析结果一致。部分太空突变株(HG-R7970-3和HG-R7970-41，D94N；HG-R7970-16和HG-R7970-20，K70E)被发现具有相同的非同义突变，并被分配到系统发育树的同一分支。太空突变株HA-R7970-36(R97W)和HG-R7970-25(S63Y)在ywqD基因上表现出不同的SNP。有趣的是，突变体HG-R7970-3和HG-R7970-41具有相同的非同义突变，比在ywqD基因其他位置具有SNP的突变体产生明显更多的CPS。如表1所示，除ywqD外，其他非同义SNP分布在多个基因中，包括粘稠太空突变株中的gph1和oppF3，非粘稠太空突变株中的pycA、polC和manX3，地面分离株中的uvrC(SG-R7970-14)。非粘稠太空突变株HG-R7970-46和地面分离株SG-R7970-16均未检测到突变位点。在编码假设蛋白质的两个不同基因中也检测到两个非同义SNP。这些含有SNP的非同义基因大多编码具有关键生理功能的蛋白质，包括编码DNA聚合酶的pycA；polC编码丙酮酸羧化酶，manX3编码磷酸转移酶系统甘糖特异性EIIAB成分，参与碳水化合物运输和代谢；oppF3编码寡肽转运ATP结合蛋白，参与细胞膜转运；gph1编码磷酸乙醇酸磷酸酶，参与脂质代谢。然而，这些基因似乎更多地与细胞代谢相关，但与粘稠表型没有直接联系。由于所有的粘稠突变株都有一个共同的特征，即在ywqD中获得一个SNP，并且ywqD参与调控CPS的生物合成，CPS的产生量与ywqD基因中的SNP位点相关，因此可以合理地假设粘稠表型和CPS合成的诱导是由ywqD基因突变引起的。
图4 太空和地面分离株的基因组特征。(a)太空突变株(HG-R7970-3、HG-R7970-16、HG-R7970-20、HGR7970-25、HG-R7970-28、HG-R7970-34、HG-R7970-41、HG-R7970-46、HA-R7970-19、HA-R7970-36)和地面对照株(SG-R7970-14、SGR7970-16)参考原Probio-M9基因组的基因组图谱。(b)系统发育树(左)和分离株和Probio-M9中不同基因中SNP的分布(右)。这四种类型的DNA核苷酸用不同的颜色表示。红框表示ywqD基因中的SNP。
“—”，该SNP位于基因间区域或基因名称不可用。太空突变株HG-R7970-46(非粘稠)和地面分离株SG-R7970-44均未检测到突变位点。
4、 在Probio-M9基因组中鉴定出完整的CPS基因簇检查了Probio-M9基因组中ywqD的上游和下游序列，确定了一个完整的CPS基因簇，包括17个基因，横跨18018 bp的基因组区域(图5a)。对所有测序突变株的多序列比对显示，CPS基因簇中的基因长度和数量没有差异，点突变仅在ywqD基因中被发现。在已鉴定的CPS簇中，每个基因编码的蛋白质的预测功能、结构域和跨膜螺旋如表2所示。除了ORF2014(对应于wzr基因)，CPS簇中的所有基因都在同一个方向上(图5a)。CPS基因簇很可能编码产生杂多糖的Wzx/Wzy依赖通路。根据每个基因的同源功能域和预测的跨膜螺旋，预测每个基因的假定功能(图5a；表2)。三个基因(wzb、wzd和wze，分别对应ORF2013、ORF2029、ORF2028)编码调控CPS合成的蛋白，特别是链长决定。wze基因(也称为ywqD)与CpsD/CapB家族酪氨酸蛋白激酶具有高度同源性。wzr(ORF2014)编码了一种推测的多糖生物合成转录调控因子。welE、welF、welG、welH、welI和welJ(分别为ORF2015、ORF2026、ORF2025、ORF2024、ORF2023和ORF2021)编码糖基转移酶(GTs)，用于合成多糖重复单元。rmlA、rmlB、rmlC和rmlD(ORF2016至ORF2019)编码构成完整的DTDP-L-鼠李糖生物合成途径的酶。wzm(ORF2020)与一种多糖丙酮基转移酶同源性高(99%)。wzy(ORF2022)编码EpsG家族多糖聚合酶。wzx(ORF2027)编码一种翻转酶，在所有预测的蛋白质中具有最高数量的跨膜螺旋，它可能在运输多糖重复单位中很重要。YwqD蛋白由250个氨基酸组成，所有6个分析的粘稠太空突变株的YwqD非同义突变位于蛋白的N端(HG-R7970-3和HG-R7970-41，D94N；HG-R7970-16和HG-R7970-20，K70E；HGR7970-25 S63Y；HA-R7970-36 R97W)。先前的一项研究发现，用丙氨酸替换天冬氨酸-81和/或天冬氨酸-83(对应于Probio-M9的YwqD蛋白中的天冬氨酸-92和-94)几乎完全消除了枯草芽孢杆菌YwqD的ATP酶活性，纯化的突变蛋白(YwqD-81和YwqD-83)没有任何自磷酸化活性。有趣的是，两个具有最高CPS产量的粘稠太空突变株(HG-R7970-3和HG-R7970-41)表现出D94N突变，这可能是蛋白质正常功能所需的活性位点。对Probio-M9和6个粘稠太空突变株的wze/ywqD基因产物进行三维三级结构预测，并与Probio-M9原ywqD蛋白进行比较(图5b)，可以看出，非同义突变改变了突变株蛋白结构。这些结果表明，Probio-M9粘稠太空突变株中CPS产生的激活是由于特定氨基酸和/或YwqD蛋白结构的修饰。
图5 (a) Probio-M9的CPS基因簇的组织。预测基因产物的假定功能由不同的颜色表示:紫色是调节CPS合成的蛋白质，特别是在决定链长方面，由wzb、wzd和wze编码；蓝色，假定的多糖生物合成转录调控因子，由wzr编码；粉红色，糖基转移酶，用于合成多糖重复单元，由welE、welF、welG、welH、welI和welJ编码；绿松石，构成dTDP-L-鼠李糖生物合成途径的酶，由rmlA、rmlB、rmlC和rmlD编码；黄色，多糖丙酮转移酶，由wzm编码；红色，EpsG家族多糖聚合酶，由wzy编码；绿色，翻转酶，由wzx编码。(b)太空突变体(上)Wze蛋白(一种假定的酪氨酸蛋白激酶，由wze/ywqD编码)的三级结构模型与Probio-M9 Wze蛋白(下)的SWISS-MODEL比较。红圈表示预测蛋白质的突变区域。部分分离株wze基因发生相同突变，包括分离株HGR7970-16和HG-R7970-20，分离株HG-R7970-3和HG-R7970-41。
表2 鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9荚膜多糖簇中鉴定的基因。
5、在转录组和蛋白质组水平上，粘稠太空突变株中的整体和CPS基因表达为了进一步了解粘稠突变株的分子变化，特别是与CPS产生相关的代谢变化，我们将CPS产量最高的两个粘稠太空突变株(HG-R7970-3和HG-R7970-41)与地面分离株(SG-R7970-16)在转录组和蛋白质组水平上进行了整体和CPS基因表达的比较分析(图6)。在转录组和蛋白质组水平上观察到两个太空突变株的巨大变化。在转录组水平上，HG-R7970-3有395个基因显著上调，396个基因显著下调(图6a)；HG-R7970-41有457个基因显著上调，445个基因显著下调(图6b)。在蛋白质组学水平上，HG-R7970-3有497个蛋白显著上调，339个蛋白显著下调(图6c)；HG-R7970-41有464个蛋白显著上调，332个蛋白显著下调(图6d)。两个太空突变株共有大量共同上调/下调基因/蛋白，其中上调基因347个，下调基因329个，上调蛋白421个，下调蛋白299个(图S2)。这些差异表达的基因和蛋白质中的一些可能是由粘稠太空突变株产生CPS的原因。基于京都基因和基因组百科全书数据库的注释显示，这些常见的差异表达基因/蛋白大多属于碳水化合物代谢和膜转运途径(图6e和f)，这表明这些粘稠太空突变株中CPS的产生与碳水化合物代谢的改变有关。由于CPS基因簇负责细菌CPS的生物合成，因此我们重点分析了CPS基因簇及其编码蛋白的差异表达。在两种太空突变株中，CPS基因簇的表达存在明显差异(表3)。在转录组水平上，太空突变株的6个CPS基因簇(welE、rmlB、rmlC、rmlA、wzm和wze)表达增加，1个基因(wzy)表达减少，10个基因(wzb、wzr、rmlD、welJ、welI、welH、welG、welF、wzx和wzd)与地面对照相比无明显变化。在蛋白质组学水平上，与地面对照相比，粘稠太空突变株CPS簇中2个蛋白(Wzb和Wzd)表达增加，9个蛋白(RmlD、RmlB、RmlA、WelJ、Wzy、WelI、WelH、WelG和WelF)表达降低，6个蛋白(Wzr、WelE、RmlC、Wzm、Wzx和Wze)表达无明显变化。尽管一般情况下，两株粘稠太空分离株CPS基因簇的转录和翻译表达存在较大差异，但差异基因和蛋白质表达模式在两株突变体之间高度一致，证实了太空暴露后它们发生了相似的生理变化，这种变化可能与它们共同的wze基因突变有关。
图6 太空突变株HG-R7970-3(a和c)和HG-R7970-41(b和d)的转录组和蛋白质组数据的火山图，与地面对照分离株SG-R7970-16进行比较。x轴表示mRNA/蛋白表达的倍数变化(以log2尺度)，y轴表示差异表达的统计显著性(P值由t检验生成，以log10尺度显示)。(e和f)显示差异表达基因(DEGs)和蛋白质(DEPs)在不同京都基因和基因组百科全书(KEGG)亚类中的分布的水平柱状图。每个柱状图旁边的数字表示分布到该KEGG子类的DEG和DEP的数量。
表3 太空突变株和地面分离株之间荚膜多糖簇基因的差异表达。
HG-R7970-3和HG-R7970-41是太空突变株；SG-R7970-16是地面分离株。
为了实际应用，有必要确保太空突变株的表型和基因型稳定性。因此，我们评估了CPS产量最高的粘稠突变株HG-R7970-41的遗传稳定性。在连续传代过程中，我们检测了不同代的粘稠表型、包膜形成、CPS产量和SNP稳定性。发现粘稠的菌落形态、荚膜形成和CPS产量(整个传代过程中0.33 g/L)稳定(图7a和b)。在0代、240代、480代、720代和960代传代后，通过对Probio-M9和HG-R7970-41的细胞进行重测序来检测SNP的稳定性。Probio-M9表现出更高的稳定性，在720代生长后仅检测到一个新的同义SNP。相比之下，HG-R7970-41在传代过程中获得了更多SNP。在基因间区域和ywqD基因内的两个太空诱导突变在整个细胞传代中稳定地遗传(图7c)。因此，太空暴露诱导的突变在基因上是稳定的，很可能对突变体造成长期的生理变化。我们的数据支持太空诱变可用于将新的特性(在本例中为CPS生产)引入Probio-M9。
图7 HG-R7970-41表型和遗传稳定性研究。(a)所选太空突变株(HG-R7970-41)连续传代后的粘稠表型及其相应的显微形态(墨汁荚膜染色)(以生长的世代表示)。(b)连续传代后荚膜多糖产量(以葡萄糖为标准测定)。误差条表示标准差(b)。(c)突变株和Probio-M9基因组在0代、240代、480代、720代和960代后的系统发育树(左)和各基因SNP的分布(右)(c)。四种DNA核苷酸用不同颜色表示。红框突出了ywqD基因中的SNP。
讨论
太空微生物学主要集中在研究太空飞行对病原体的诱变作用，只有很少的工作研究了太空暴露对有益微生物的影响。因此，本研究对鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9进行了太空诱变实验，目的是探究诱导益生菌发生稳定的生理变化，从而拓展其未来的应用潜力是否是一种可行策略。我们使用整合基因组学、转录组学和蛋白质组学来描述获得的太空突变株的生理变化，特别是它们的表型和CPS产生的机制。在研究中，分析了100个Probio-M9的太空突变株。有趣的是，大约三分之一(35/100)的太空突变株表现出相当大的菌落大小的粘稠表型，这与它们新获得的产生大量CPS的能力有关。事实上，相对较大比例的Probio-M9太空突变株表现出类似的获得性表型，这表明太空诱导突变不是随机的。特别是，我们的SNP分析揭示了突变株中一些高SNP密度区域，集中在CPS基因簇中。在我们的航天实验中，Probio-M9的生长介质(MRS琼脂和稀释甘油)没有任何特定的环境选择力。因此，诱变完全是由空间环境引起的。研究发现wze基因的突变直接触发了CPS的分泌，这表明在太空突变株中wze基因突变位点是潜在的调控位点，通常会抑制CPS的分泌。因此，wze基因可能负责调节Probio-M9中CPS的产生。基于转录组/蛋白质组数据和现有的CPS集群文献，我们重建了CPS生物合成的模型(图8)。Wzd-Wze-Wzb作为蛋白质复合物在多糖合成中发挥调节作用。在太空突变株中，wze基因的突变似乎直接激活了Wze蛋白，这与wze在mRNA水平上的显著增加是一致的(两个太空突变株相对于地面对照的倍数变化[FC]=2.07和2.36)。此外，在多糖合成过程中，Wzy对底物的磷酸化会间接改变Wzd-Wze-Wzb蛋白复合物的结构和活性，从而影响多糖聚合。分析的分离株收集于对数生长后期，此时CPS产量可能达到平衡，蛋白质反馈将在mRNA水平抑制基因表达。在mRNA水平上抑制wzy、wzd和wze的表达也支持了我们的观点。wzy基因在mRNA水平上显著降低(两个粘稠太空突变株相对于地面对照FC分别为0.33和0.22)，导致多糖聚合受到抑制，影响多糖产量。本研究的结果支持这一观点，即三种调控蛋白(Wzd、Wze和Wzb)主要通过调控Wzy而不是多糖重复单元的合成来影响聚合，增强多糖对细胞壁的附着。在对数期结束时，与GT膜相关启动(WelE)、DTDP-L-鼠李糖合成和多糖丙酮转移酶相关的基因在mRNA水平上表达显著增加，表明多糖仍在合成，DTDP-L-鼠李糖和丙酮基是CPS的重要成分。然而，GTs的具体作用顺序还需要进一步的实验验证。总之，Wze的突变可能导致蛋白复合物(Wzd-Wze-Wzb)发生相应的变化，进而调控多糖的聚合和产量。此外，Wze突变对多糖重复单元的合成和翻转酶(Wzx)的功能没有直接影响。我们的结果也促使推测突变体产生CPS主要是通过ywqD基因反馈，调节CPS基因簇中其他基因的表达。此外，在CPS合成过程中，Wze、Wzb和Wzd之间的相互作用决定了CPS的输出过程，CPS诱导最可能的机制是通过激活Wze，影响Wzd和Wzb的结构和功能。本研究采用转录组学和蛋白质组学相结合的方法，分析了太空突变株与地面对照株CPS基因簇的表达差异。我们在转录组水平上观察到大多数CPS基因簇基因的表达增加，但在蛋白质组水平上观察到相反的趋势。事实上，mRNA水平并不能最终决定蛋白质的数量，因为mRNA的翻译可以不受mRNA水平的影响。因此，本研究中看到的转录组和蛋白质组结果之间的差异，可能是由于基因的细胞蛋白质量和mRNA拷贝数并不总是相关。研究表明，太空诱变是一种可行的方法来产生稳定生理变化的益生菌。由于ywqD基因突变，将Probio-M9暴露于太空而不施加额外的环境选择力，导致Probio-M9产生了有趣和潜在有用的粘稠和CPS产生表型。在未来的研究中，在细菌的生长介质中施加特定的选择压力，试图将突变引向所需的性状，以达到益生菌菌株改进的目的，这将是有趣的。
图8 鼠李糖乳酪杆菌中CPS生物合成的假定步骤的示意图。CPS生产的主要步骤如下。(步骤1)WelF、WelG、WelH、WelI、WelJ和WelE(糖基转移酶)将不同的核苷酸糖添加到位于内膜的十一烯酰焦磷酸(UndPP)-脂质载体上。(步骤2)通过翻转酶Wzx将UndPP连接的多糖重复单元从内膜的内小叶转移到外小叶。(步骤3)多糖重复单元经Wzy聚合形成长多糖。(步骤4)Wzd、Wzb、Wze、Wzr调控长多糖的聚合和输出。考虑到当前的转录组学和蛋白质组学数据，这一数字改编自以前的研究。
结论
本研究采用转录组学和蛋白质组学相结合的方法，分析了太空突变株与地面对照株CPS基因簇的表达差异。结果显示，与原始Probio-M9或未暴露于太空的地面对照菌株相比，相当大比例的太空突变株由于wze(ywqD)基因突变表现出粘稠表型并可稳定遗传。结果证实，wze基因直接影响Probio-M9中CPS的产生能力，太空诱变是诱导益生菌稳定生理变化的潜在策略。
原文链接：https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.04677-22
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