香港中文大学于君:结直肠癌患者肠道真菌失调与生态改变

近年来，结直肠癌在全球发病率急剧上升。肠道微生物作为一个复杂的生态系统，在结直肠癌的发生发展过程中发挥着重要作用。相关研究已经证实，肠道菌群和病毒体的改变与结直肠癌有关。例如，来自结直肠癌患者的供体肠道菌群已被证明可在无菌小鼠模型中诱导肿瘤发生。然而，肠道真菌由于其相对较少的丰度和缺乏特征良好的参考基因组，使其与结直肠癌的关系仍未得到充分的研究。随着高通量测序方法的不断进步，为获得肠道微生物群的非细菌成分提供了便利。基于此，研究肠道真菌与结直肠癌发生发展之间的关系，将对肠道菌群除细菌之外促进肿瘤发生的未知机制提供更深入的了解。

    论文ID

    原名：Enteric fungal microbiota dysbiosis and ecological alterations in colorectal cancer

    译名：结直肠癌患者肠道真菌失调与生态改变

    期刊：Gut

    IF：17.016

    通讯作者：于君教授

    通讯作者单位：香港中文大学

    实验设计

    在本研究中，研究者利用宏基因组测序技术对来自香港的184例结直肠癌患者，197例腺瘤患者和204例对照的粪便样本进行测序分析。其中，实验组：73例结直肠癌患者和92例对照；验证队列：111例结直肠癌患者，197例腺瘤患者和112例对照。此外，还在已发表的来自德国和法国的90例结直肠癌患者、42例腺瘤患者和66例对照的独立队列中，验证了与结直肠癌相关的真菌标志物和生态的改变。

    实验内容

    临床受试者的统计学和临床资料

    招募标准为在胃肠科门诊陈述消化道症状和年龄超过50岁的无症状个体。所有结直肠癌患者在收集粪便时均有无损的结肠病变。收集粪便样本，4小时内置于- 20℃，24小时内置于- 80℃保存长期储存。来自德国和法国的90例结直肠癌患者、42例腺瘤患者和66例对照被指定为下图所示的欧洲队列V2，进一步证明真菌标记物的诊断潜力。

    表1临床受试者的统计学和临床资料。注： Chinese cohort 1（学习队列）和Chinese cohort 2（验证队列1）来自香港的结肠直癌患者、结肠腺瘤患者及健康对照组；German and French（验证队列2）样本为已发表的来自德国和法国的90例结直肠癌患者、42例腺瘤患者和66例对照，用来与本文的结果做对比。

    结直肠癌肠道真菌的改变

    无监督主成分分析(RDA)和监督冗余分析(RDA)均显示，肠道菌群将肠癌和对照组区分为明显不同的两组（p=0.0006 and p=0.001），表明肠癌与健康受试者相比具有独特的肠道共生真菌特征。此外，RDA分析还发现，真菌成分在对照组、早期肠癌(TNM I期和II期)和晚期肠癌(TNM III期和IV期)中形成不同的聚类，显示了结直肠癌阶段特异性真菌群落稳态被破坏的。然而，以物种丰富度和Shannon多样性来衡量的肠道真菌alpha多样性在肠癌组和对照组之间并没有显著差异。上述结果表明，肠道共生真菌成分的改变与结直肠癌的发生有关。

图1 结直肠癌肠道真菌的改变。A. 基于Bray-Curtis距离算法的无监督主成分分析利用真菌组成谱对结直肠癌患者和对照组进行区分；B. 基于有监督的多变量冗余分析利用真菌组成谱对结直肠癌患者 (73例)和对照组(92例)进行区分。RDA1和RDA2表示反映大部分多样性的两个主要坐标，以百分比表示。组间比较采用Mann-Whitney U检验；C. 阶段特异的肠道真菌成分多元冗余分析，对照组(92例)，早期肠癌患者(20例)，晚期肠癌患者(54例)，RDA1和RDA2表示反映大部分多样性的两个主要坐标，以百分比表示；组间比较采用Kruskal-Wallis检验；D. 肠癌患者 (73例)与对照组(92例)的丰富度和Shannon指数；

    结直肠癌肠道真菌的分类特征及分布

    在肠道真菌分类群中，子囊菌门Ascomycota占主导地位，而担子菌门Basidiomycota在肠癌组和对照组中都是丰度仅次于Ascomycota (图2A)。此外，担子菌门Basidiomycota和粘孢子菌门Mucoromycota 的比值反映了肠道共生真菌的失调，该比值肠癌组显著高于对照组(图2B)。同时发现，与对照组相比，肠癌组中Saccharomycetes和Pneumocystidomycetes明显减少，Malasseziomycetes显著富集(图2C)。在科水平上，与对照组相比，Lipomycetaceae 在肠癌组显著降低，而Pisolithaceae, Marasmiaceae, Malasseziaceae, Erysiphaceae, Pseudorotiaceae 和Chaetomicaeae在肠癌组则显著升高(图2D)。在属水平上，与对照组相比，Malassezia, Moniliophthtora, Rhodotorula, Acremonium, Thielaviopsis 和Pisolithus 在在肠癌组则显著富集(图2E)。

图2结直肠癌肠道真菌的分类特征及分布。A. 肠癌患者 (73例)与对照组(92例)的优势肠真菌门的相对丰度，两组优势门均为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和粘孢子菌门（Mucoromycota）； B. 肠癌患者 (73例)的Basidiomycota / Ascomycota 比例（真菌失调的指标）显著高于对照组(92例)，(**p<0.001, Mann-Whitney U 检验)；C. 肠癌患者 (73例)与对照组(92例)真菌丰富程度不同，使用多元统计模型检测丰度差异，并对年龄、体重指数(BMI)和性别等混杂因素进行校正； D. 结直肠癌与对照组真菌科水平的丰富程度不同，使用多元统计模型检测丰度差异，并对年龄、BMI和性别等混杂因素进行校正； E. 结直肠癌与对照组真菌属水平的丰富程度不同，使用多元统计模型检测丰度差异，并对年龄、BMI和性别等混杂因素进行校正；

    真菌可以作为结直肠癌诊断标志物

    经年龄、性别、BMI等混杂因子校正后，研究者发现有38种真菌在肠癌中的丰度与对照组相比有显著差异。其中29个是肠癌组富集的，另外9个是肠癌组缺失的(图3A)。发现Aspergillus flavus, Kwoniella mangrovensis, Pseudogymnoascus sp. VKM F-4518, Debaryomyces fabryi, A. sydowii, Moniliophthora perniciosa, K. heavenensis, A. ochraceoroseus, Talaromyces islandicus, Malassezia globosa, Pseudogymnoascus sp. VKM F-4520, A. rambellii, Pneumocystis murina 和Nosemia apis具有两倍以上丰度变化的物种的诊断潜力。研究者利用这些菌株对肠癌组和对照组进行分类，得到的AUC为0.93，该模型同样可区分早期肠癌组和对照组，得到的AUC为0.91。(图3B)。

图3真菌可以作为结直肠癌诊断标志物。A. 热图显示结肠癌患者 (73例) 与对照组(92例)的平均相对丰度相比，其真菌种类的相对变化；B. 用logistic regression对学习队列中利用真菌标志物对肠癌进行分类的诊断效果进行评估，校正混杂因素，包括年龄，体重指数(BMI)和性别。

    结直肠癌粪便真菌诊断标志物在独立队列中的验证

    在中国独立的包括112名对照组、197名腺瘤患者和111名肠癌患者的验证队列V1中，研究在学习队列中所挖掘的真菌分类法的效能。在验证队列1中，与对照组相比，该真菌标记物可对肠癌患者进行明显的分层，AUC为0.82，而用于区分对照组和早期肠癌患者的AUC为0.81(图4A)。此外，还在不同种族的欧洲队列V2中进行验证(图4B)，在验证队列2中，用于区分对照组（66例）和肠癌（90例）中的AUC值为0.74；用于区分对照组（66例）和早期肠癌（32例）中的AUC值为0.71。

图4结直肠癌粪便真菌诊断标志物在独立队列中的验证。A. 在验证队列1中，标志物在用于区分对照组（112例）和肠癌（111例）中的AUC值为0.82；用于区分对照组（111例）和早期肠癌（61例）中的AUC值为0.81；用于区分对照组（111例）和早期肠癌（61例）中的AUC值为0.81；用于区分对照组（111例）和腺瘤患者（197例）中的AUC值为0.63；B. 在验证队列2中，用于区分对照组（66例）和肠癌（90例）中的AUC值为0.74；用于区分对照组（66例）和早期肠癌（32例）中的AUC值为0.71；用于区分对照组（66例）和腺瘤患者（42例）中的AUC值为0.6；

    结直肠癌肠道真菌内部微生态及细菌-真菌间的相互作用

    由于结直肠癌的复杂性和多因素性，研究者通过估计肠道共生真菌内部和细菌-真菌间的相关性来研究结直肠癌发生发展过程中，多种微生物生态相互作用的潜在变化。分析发现，在结直肠癌组肠道共生真菌间的作用具有更多的正相关和更强的相互作用。在对照组中，真菌和细菌之间的相关性比在肠癌组中更少且有更多更强的互斥关系，而在肠癌组中增强的真菌内共生和细菌-真菌共排斥相关网络在学习队列V1和V2中得到进一步验证。

 

图5结直肠癌肠道真菌内部微生态及细菌-真菌间的相互作。A.结直肠癌与对照组相比具有较强的共生生态网络，在肠癌患者中，子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和粘孢子菌门（Mucoromycota）之间出现了新的相关性；B. 与对照组相比，肠癌患者中不同数量的真菌和细菌科之间存在着生态网络；

    结论

    该研究阐明了在结直肠癌发生中对肠道菌群稳态的破坏作用，并证实了粪便真菌标志物在结直肠癌检测中的潜在价值。与此同时，研究者揭示了结直肠癌特异的真菌内部微生态及细菌-真菌间交互网络的改变，提示肠道真菌内部协同作用或细菌-真菌间的拮抗作用可能导致结肠癌的发生。

    评论

    尽管哺乳动物微生物群的真菌组成可能不到所有共生微生物种类的1%，相关的研究已经证明了其在肠道中的重要性，例如，不同的肠道真菌群落和多样性与IBDs和肝硬化有关。肠道共生真菌和细菌在肠道内共存，肠道真菌在宿主免疫系统的发育和维持中起着稳定的作用，在肠道内和肠道外疾病中都可能发生改变。因此，它们在肠道中的相互作用模式可能在肠癌状态下发生改变，并可能反映其在肠癌中的潜在作用。有研究发现，在27例结直肠腺瘤和邻近组织的组织活检中发现了真菌成分的差异，提示宿主相关真菌群的改变与肠癌的发生有关。了解结直肠癌与健康人相比的肠道共生真菌多样性和丰度对于阐明真菌在结直肠肿瘤发生中的潜在作用具有重要意义。同时，粪便真菌异常波动也可为利用真菌作为肠癌的非侵入性诊断生物标志物开辟新的思路。