干酪乳杆菌Zhang对不同地区人群肠道菌群的影响干酪乳杆菌Zhang对不同地区人群肠道菌群的影响

不同地区人群，拥有不同的生活方式和饮食习惯，这导致了不同地区人群的肠道菌群具有较大的差异性。干酪乳杆菌Zhang (L. casei Zhang) 作为我国第一株完成全基因组测序的乳酸菌，具有诸多益生功效，目前在临床上得到证实，可以改善脂质代谢、预防II型糖尿病、缓解呼吸道感染等。本试验研究L. casei Zhang对不同地区人群差异化肠道菌群的影响，将为L. casei Zhang对不同类型人群的效果提供数据支持。

    试验设计

    试验过程

    1.试验对象

    从国内外6个不同地区共招募106名青年志愿者（18-28岁）。其中：中国新疆（22名）、中国内蒙古（16名）、中国甘肃（12名）以及蒙古国（12名）、印度尼西亚（23名）和新加坡（21名）。

    2.试验过程

    进行为期14天的益生菌干预试验，试验期间每日午饭后摄入100亿CFU的益生菌L. casei Zhang(5×109CFU/g)菌粉。采集试验前（0天）、试验7天、14天和停止试验14天后的粪便样品（图1）。

    3.试验方法

    基于PacBio SMRT细菌16S全长测序，在种水平评价L. casei Zhang对不同地区人群肠道菌群的影响。通过乳酸菌特异性引物，准确获取粪便样品中乳酸菌的丰度和多样性，揭示L. casei Zhang对肠道中益生菌群的影响。

图1:试验设计详情

    试验结果

    1.试验前不同地区人群肠道菌群结构

    新加坡地区人群厚壁菌门菌群含量较高，而蒙古国和中国内蒙古地区人群则是拟杆菌门菌群含量较高（图2a）。在属和种的水平上共鉴定出241个属（其中17个属平均相对丰度大于1%；图2b）和503个种（其中13个种平均相对丰度大于1%；图2c）。发现蒙古国、中国内蒙古、印尼和中国新疆地区人群肠道菌群物种数目（图3a）和多样性（图3b）显著高于新加坡和中国甘肃地区。其中地域是影响肠道菌群最主要的因素(P<0.001)，高于BMI和性别的影响。

图2:采集地分布以及不同地区人群肠道菌群结构

图3:不同地区人群肠道菌群物种数目和多样性详情

    2.肠型以及代谢途径分析

    根据肠道菌群聚类分析，可以观察到两个群级即PC1阳性和PC1阴性区域（图4a）。由此所有志愿者可以分为两个不同的肠型，分别为肠型FB（PC1阴性）和肠型PF（PC1阳性）。肠型FB主要含有普氏栖粪杆菌(F. prausnitzi)、多氏拟杆菌(B. dorei)（共54人，占50.9%）；肠型PF主要含有肠道普氏菌(P. copri)、普氏栖粪杆菌(F. prausnitzi)（共52人，占49.1%）。其中新加坡76%和中国内蒙古69%的人群属于肠型FB，印尼65%和中国甘肃66%人群属于肠型PF，蒙古国和中国新疆地区两个肠型人数相当（图4b）。

    L. casei Zhang干预后，肠型FB人群数量持续升高，在摄入L. casei Zhang第14天时，该肠型人群的比例达到75.5%。肠型FB人群B. vulgatus（普通拟杆菌，丙酸盐产生菌）的相对含量持续升高(P < 0.05)；多氏拟杆菌（与I型糖尿病风险增加有关）显著下降(P <0.05)；肠型PF人群直肠真杆菌（短链脂肪酸生产菌）相对含量持续升高。

图4:肠道菌群聚类分析以及不同地区人群肠型分布详情

所有样品共预测得到5668个KEGG同源物，发现了81种代谢模块。其中三种模块(M00320，M00060和M00080)在PF肠型中较为丰富，与脂多糖的合成有关。而FB肠型中某些必需氨基酸的合成模块较为丰富，包括亮氨酸合成(M00432)、异亮氨酸(M00535)和组氨酸合成(M00026)。

    L. casei Zhang的摄入可以显著降低肠道菌群有害代谢途径如脂多糖生物合成的丰度，同时显著促进多种氨基酸转运和合成通路的丰度，有利于肠道菌群将食物中的营养物质转变为各类氨基酸，促进宿主健康。

    3.干预后不同地区人群肠道菌群结构

    试验0天、7天、14天以及停止治疗后14天后的肠道菌群进行样品间差异检测，图5a和b显示了未加权和加权UniFrac距离统计的散点图。结果发现同一地区的样品在消耗L. casei Zhang的前后有明显的聚集趋势。根据加权UniFrac计算出变化不同时间的距离，发现中国甘肃以及中国新疆的试验者的肠道菌群结构趋于融合，中国内蒙古参与者之间个体差异有所增加，而印尼和新加坡的肠道菌群结构变化不大；对比六个地区的变化趋势，发现中国新疆和蒙古国的肠道菌群变化明显大于印尼，新加坡的肠道菌群变化差异是6个地区里最小的（图5c、d）。综合以上内容，对不同地区“肠道菌群易变指数(GMVI)”进行分析发现该指数由高到低分别为：中国新疆>蒙古国>中国内蒙古>印尼>中国甘肃>新加坡。

图5:试验前后样品间差异性分析

    L. casei Zhang摄入显著增加了部分地区人群直肠真杆菌(Eubacterium rectale，丁酸盐生产菌)、粪便罗伊氏杆菌(Roseburia faecis，为结肠细胞提供能量)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens，糖尿病患者中该菌会下降)的相对含量。而卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus，感染中常见菌之一)和皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii，有助于代谢紊乱)在部分地区持续显著下降。

    4.乳酸菌含量的检测

    基于乳酸菌特异性引物从所有样品中共检测到5个属和122个种，远高于基于16S通用引物检测得到的65个（图6a、b）。瘤胃乳杆菌(L. ruminis)、唾液链球菌(S. salivarius)、嗜热链球菌(S. thermophilus)、德氏乳杆菌(L. delbrueckii)、耐久肠球菌(E. durans)是青年人群乳酸菌的主要优势菌种（图6d、f）。

    随着L. casei Zhang的摄入，不同地区人群肠道中乳酸菌的丰度和干酪乳杆菌的绝对含量有增加的趋势。其中，中国内蒙古的试验者肠道菌群中乳酸菌丰度和多样性最高，显著高于印尼和新加坡（图6c、e）。L. casei Zhang摄入期间，其他乳酸菌种相对含量亦发生了一定的改变，如鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus)含量下降、惰性乳杆菌(L. iners)含量上升、戊糖乳杆菌(L. pentosus)含量下降仅在个别地区人群中发生了显著变化。

图6:乳酸菌试验前后在不同地区含量详情

    试验结论

    干酪乳杆菌Zhang可以有效改善不同地区人群的肠道菌群；对人体有益的FB肠型人数持续增加；显著降低肠道菌群有害代谢功能的丰度。干酪乳杆菌Zhang还可以有效改善不同地区人群的肠道菌群，增加乳酸菌的含量。但地域以及不同个体在试验前的原始肠道菌群状态，也是影响干酪乳杆菌Zhang改善肠道菌群效果的重要影响因素。