干酪乳杆菌Zhang通过调控肠黏膜完整性、紧密连接蛋白和免疫因子表达，预防大肠杆菌K88诱导的早期断奶仔猪空肠上皮损伤

早期断奶仔猪的消化系统和免疫功能尚未成熟，加上环境压力的影响，可能导致仔猪肠道微生态失衡，从而出现消化不良、腹泻等症状，也影响其生长发育。断奶仔猪的腹泻通常是由肠道毒性大肠杆菌感染引起的，大肠杆菌会通过菌毛粘附素粘附在小肠微绒毛上，产生大量肠毒素，导致病理性或炎性状态。在仔猪日粮中添加益生菌可以提高肠道免疫防御能力，调节炎性细胞因子的释放，显著改善病原体入侵引起的腹泻症状，从而改善断奶仔猪的生长性能。本研究旨在探讨干酪Zhang是否能增强早期断奶仔猪肠粘膜对大肠杆菌K88的机械屏障和免疫功能，从而为干酪Zhang作为新型仔猪饲料添加剂的应用提供理论依据。

　　实验设计

　　本研究共选取健康水平一致的14日龄杜洛克×长白猪×约克郡断奶仔猪144头，随机分为6组，每组4个重复，每个重复6头仔猪。（基础日粮中添加干酪Zhang制备益生菌日粮，制备完成的益生菌日粮中含干酪乳杆菌Zhang 107 CFU/g 。大肠杆菌（O149:K91，K88ac）制成菌悬液后，以 1010 CFU/头的剂量通过灌胃一次性给药进行感染）。具体信息如下表所示：

从重复组中随机选一头仔猪，每组选四头仔猪进行试验。处死后取2cm空肠，用PBS冲洗后固定在4%多聚甲醛中进行空肠形态分析，并对增殖细胞核抗原（PCNA）和紧密连接蛋白（ZO-1和闭塞素）的表达分布进行免疫组化分析。另取 5cm空肠，用PBS冲洗后放入充满RNA的管中，储存在−80℃，以待分析toll受体（TLR2、TLR4和TLR9）、肠道细胞因子（白细胞介素IL-10、IL-17和肿瘤坏死因子TNF-α）和SIgA的蛋白质表达和相对mRNA表达。

　　实验结果

　　1.不同处理方式对断奶仔猪腹泻率的影响

　　正常饲养条件下，仔猪腹泻率为15.7%。感染大肠杆菌K88 后，仔猪腹泻率上升至19.8%。预防组或预防加治疗组的腹泻率分别降至13.6%和13.2%。

　　2.不同处理方式对断奶仔猪空肠形态的影响

　　干酪Zhang组（B组）肠上皮组织结构正常（图1B）。感染大肠杆菌组（C组），肠绒毛严重断裂，绒毛上皮脱落，固有层严重水肿并伴有出血，炎性细胞浸润和血管充血严重（图1C）。直接治疗组（F组）的病理变化与感染大肠杆菌组相同（图1F）。预防性饲喂干酪Zhang组（预防组即D组和预防加治疗组即E组），肠绒毛结构完整，上皮细胞排列稍乱，固有层轻度水肿，炎性细胞浸润和血管充血现象不明显（图1D和1E）。由图2可知，与对照组相比，干酪Zhang组的肠内肌肉厚度、绒毛高度和 V/C 比率显著增加。与感染组相比，预防组或预防加治疗组的肌肉厚度、绒毛高度和 V/C 比率显著增加。结果表明饲喂干酪Zhang可促进肠肌层生长，促进消化和吸收，预防大肠杆菌K88对肠上皮组织的病理损伤。

图1 不同处理方式下断奶仔猪空肠粘膜的病理变化

图2 不同处理方式下断奶仔猪空肠形态学变化

3.不同处理方式对断奶仔猪空肠增殖细胞核抗原（PCNA）含量的影响

       PCNA与细胞DNA合成密切相关，在启动细胞增殖过程中起着关键作用。在肠道中PCNA主要表达在隐窝和肠腺上皮细胞的细胞核中（图3①）。与对照组相比，干酪Zhang组PCNA表达显著增加。大肠杆菌感染组PCNA表达显著降低。预防组或预防加治疗组可显著增加PCNA的表达（图3②），并缓解感染后PCNA表达的降低。结果表明饲喂干酪Zhang可通过促进空肠粘膜上皮细胞的增殖来促进肠上皮组织的再生和修复，以防大肠杆菌K88感染，但饲喂干酪Zhang治疗大肠杆菌K88对肠上皮的感染没有显著效果。
 

图3 不同处理方式下断奶仔猪空肠增殖细胞核抗原分布和含量的变化

4.不同处理方式对断奶仔猪空肠紧密连接蛋白的分布和含量的影响

       上皮细胞之间的紧密连接蛋白是构成肠粘膜机械屏障的另一个结构基础。在免疫组化图谱中，紧密连接 蛋白ZO-1（图4①）和闭塞素（图4②）主要定位于绒毛柱状上皮和肠腺上皮之间。与对照组相比，干酪Zhang组的紧密连接蛋白阳性细胞密度显著增加，而大肠杆菌感染组的紧密连接蛋白阳性细胞密度显著降低，预防组或预防加治疗组显著缓解了这种变化，直接治疗组和大肠杆菌感染组之间未观察到显著差异。蛋白印迹分析表明，与对照组相比，干酪Zhang组空肠紧密连接蛋白表达水平显著增加。与大肠杆菌感染组相比，预防组和预防加治疗组的紧密连接蛋白表达水平显著升高（图5）。综上，饲喂干酪Zhang可以增强上皮细胞之间的紧密连接。
 

图4 不同处理方式下断奶仔猪空肠紧密连接蛋白分布变化

 

图5 不同处理方式下断奶仔猪空肠紧密连接蛋白含量变化

5.不同处理方式对断奶仔猪空肠Toll受体及细胞因子基因表达的影响

　　肠粘膜通过细胞免疫和体液免疫防止致病性抗原对机体造成损害，而免疫信号分子促进或抑制淋巴细胞活化。由图6可知，与对照组相比，干酪Zhang组中TLR2 mRNA的表达显著增加，而TLR4 mRNA的表达没有显著差异；与大肠杆菌感染组相比，预防组和预防加治疗组中TLR2 mRNA的表达显著增加，TLR4 mRNA的表达显著降低。TLR2主要识别革兰氏阳性菌，干酪Zhang促进TLR2的表达，增强肠道抵抗感染的能力。TLR4主要识别革兰氏阴性细菌，致病性大肠杆菌K88入侵促使TLR4表达增加，并诱导炎症反应。结果表明干酪Zhang可以增强TLR2的表达，降低TLR4的表达，并减轻大肠杆菌K88诱导的炎症因子紊乱。

　　与对照组相比，干酪Zhang组显著增加抗炎因子IL-10的表达，从而增强肠道对炎症的抵抗力；大肠杆菌感染组中促炎细胞因子IL-17和TNFα的表达水平显著升高，扩大了肠道炎症反应；与大肠杆菌感染组相比，预防组、预防加治疗组和直接治疗组的IL-17 和TNFα表达水平显著降低（图6）。结果表明干酪Zhang可降低促炎因子的表达和炎症反应。
 

图6 不同处理方式下断奶仔猪空肠toll受体和细胞因子表达的变化

6.不同处理方式对断奶仔猪空肠sIgA分布的影响

       sIgA参与肠道的体液免疫，可选择性地包裹革兰氏阴性细菌，形成抗原抗体复合物，有效防止细菌粘附到肠粘膜上。在肠腺中观察到sIgA的免疫反应物质（图7①）。与对照组相比，大肠杆菌感染组的sIgA水平显著降低，肠道局部免疫功能降低。与大肠杆菌感染组相比，预防组或预防加治疗组的sIgA水平显著升高（图7②）。干酪Zhang可促进sIgA的分泌，sIgA与大肠杆菌K88在粘膜上形成免疫复合物，增强肠道局部免疫功能。
 

图7 不同处理方式下断奶仔猪空肠sIgA分布和含量变化

 

实验结论

　　综上所述，干酪Zhang可通过调控肠粘膜完整性、紧密连接蛋白和免疫因子表达，预防大肠杆菌引起的早期断奶仔猪的空肠上皮损伤，降低腹泻发病率，具有较大的替抗潜力，可作为新型饲料添加剂用于仔猪健康养殖。