乳杆菌乳头消毒剂有效改善患隐性乳房炎奶牛乳头微生物群落

A novel Lactobacilli-based teat disinfectant for improving bacterial communities in the milks of cow teats with subclinical mastitis 

文章信息： Jie Yu, Yan Ren, Xiaoxiao Xi, Weiqiang Huang and Heping Zhang*. A novel lactobacilli-based teat disinfectant for improving bacterial communities in the milks of cow teats with subclinical mastitis. Frontiers in Microbiology, DOI: 10.3389/fmicb.2017.01782.

创新点：

1.  实验首次采用复合乳酸菌乳头清洗剂作为化学性药浴液替代品，对患隐性乳房炎奶牛进行挤奶前及挤奶后的乳头清洗，进而达到对奶牛隐性乳房炎的防治作用。

2.  实验采用单分子实时测序的方法，从牛乳微生物群落结构变化的角度对复合乳酸菌乳头清洗液及商业药浴液对奶牛隐性乳房炎的防治效果进行综合评价。

摘要：

在挤奶前以及挤奶后对奶牛乳头进行清洗消毒，对奶牛的整体健康和卫生都至关重要。本研究选取11头荷斯坦奶牛，共收集原料乳样品69份，对比分析不同乳头消毒剂对奶牛体细胞数(SCC)以及乳头细菌群落的影响。经过商业化乳头消毒剂（CD）和基于益生菌制成的乳头消毒剂（LAB）均能够使牛乳中体细胞数显著降低，并且与CD相比LAB消毒后的奶牛SCC更低。通过单分子实时测序技术（SMRT）对69份样品进行菌群结构分析，LAB组与CD组的生牛奶均含有多样化的菌群，随着消毒剂的使用发生变化。同时，基于LAB的乳头消毒剂可以减少乳腺炎相关细菌，并改善奶牛乳头的微生态环境。 

关键词：

隐性乳房炎，乳酸菌，乳头消毒剂，单分子实时测序，细菌群落

1 研究背景：

奶牛乳房炎是由物理、化学或微生物等因素刺激奶牛乳腺所引发的一种炎症反应。我国生产上一般将奶牛按有无乳房炎及其严重程度分为正常型、隐性乳房炎和临床型乳房炎。隐性乳房炎没有明显临床症状，但是在体细胞、乳汁导电率、细菌学检测和pH值上与正常型有明显不同，对牛群的危害要超过临床型乳房炎。目前，牧场通常利用化学性乳头消毒剂来阻止乳房炎的发生，然而高浓度的化学物质能够导致牛奶中的药物残留。近几年研究表明，乳杆菌在动物乳头中的存在及其在治疗乳腺炎方面的高效促使我们假设是否该功能是自然存在于乳房中，进而在保护宿主避免感染疾病方面发挥重要作用。所以我们考虑是否能够利用具有抑菌作用的乳酸菌复合制剂作为乳头清洗剂来对奶牛隐性乳房炎进行防治。

2 试验方法

69份乳样使用Omega DNA isolation kit提取样品总DNA，之后进行PCR扩增16S rRNA基因全长，最后通过PacBio单分子实时测序技术对16S rRNA基因全长进行测序分析。同时，对试验乳样进行体细胞数测定以及乳杆菌和常见致病菌定量分析。 

3 结果与讨论

3.1 体细胞测定

69份样品中的体细胞数为6.7到102×10⁴个细胞每毫升。如图1所示，经过商业化乳头消毒剂和复合益生菌乳头消毒剂清洗后，均能够使乳样中的SCC降低，并且与CD组相比较，LAB消毒后的牛乳中SCC更低。然而，用无菌水替代两种消毒剂清洗奶牛乳头两天后，牛乳中SCC显著上升，进一步说明LAB与CD消毒剂能够用来防治奶牛乳房炎。

3.2 Q-PCR测定乳样中乳杆菌及常见致病菌

乳样中与乳房炎相关的致病菌及乳杆菌的定量分析结果如图2所示。与其他组相比，在用LAB乳头消毒剂清洗10天后大肠杆菌，金黄色葡萄球菌以及无乳链球菌均有显著降低，相反乳杆菌属却显著升高。尤其是，在经过蒸馏水清洗两天后，CD组中的无乳链球菌明显高于LAB组。结果表明，LAB与CD组均能够抑制致病菌，并且LAB消毒剂在能够达到长期有效抑制无乳链球菌的效果。

 3.3 不同消毒剂清洗后牛乳中细菌组成的改变

在LAB与CD组中，相对丰度大于1%的差异菌种主要包括蜡样芽胞杆菌，弯曲芽孢杆菌，大洋芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，施氏假单胞菌以及植物乳杆菌等（图3）。其中，在清洗过程中植物乳杆菌在LAB组呈显著增加趋势，而在CD组中却没有显著改变。大洋芽孢杆菌在LAB与CD组中均呈增加趋势并且在LAB组中的相对含量显著高于在CD组。

样品中相对丰度小于1的差异细菌菌种主要包括申氏不动杆菌，粪嗜冷杆菌，蒂莫内马赛菌和变异纳西杆菌等（图4）。其中申氏不动杆菌以及产碱假单胞杆菌在实验0天能够被检测到，但是在清洗过程中其相对含量逐渐降为零。蒂莫内马赛菌在清洗六天时呈显著下降趋势，但其相对含量在使用蒸馏水清洗后呈逐渐上升趋势。另外，粪嗜冷杆菌则在实验开始时呈上升趋势而在后期逐渐呈下降趋势。 实验结果揭示了益生乳杆菌能够通过调整乳头内细菌组成从而达到预防乳房炎的效果。

4 结论

通过实验证明基于乳杆菌的乳头消毒剂能够用作挤奶前及挤奶后化学性消毒剂的替代品以保证奶牛乳房健康。并且由于许多菌种含量在清洗前与清洗后发生显著变化，表明这些菌种可以被用作检测奶牛乳房是否健康的标志物。另外，本实验也证明了单分子实时测序技术是准确分析微生物群落结构的有效工具。