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源自母乳的益生菌—Probio-M8 \Probio-M9

时间:2020-07-22 16:01来源:本站 作者:bio149发布 浏览次数:

 
  母乳是婴儿的主要营养来源,这其中包含了许多营养物质和微生物,它们将有助于发育中婴儿消化系统和免疫系统的成熟。一般健康女性母乳中菌群数目约为103至104 CFU/mL,从中可以分离得到葡萄球菌、链球菌、肠球菌、乳杆菌和双歧杆菌等,其中一部分还是潜在的益生菌。故本试验对40个人类乳样本进行分离鉴定出两株性质优异的菌株即乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9,并对其特征进行对比分析。

  试验方法

  试验设计

  1.试验对象

  从中国内蒙古自治区选取40名汉族和蒙古族健康女性,采集人类初乳样品。

  2.检测方法

  对样本中乳酸杆菌和双歧杆菌进行分离鉴定,并进行基因测序分析以及生理生化等特征的鉴定。

  试验结果

  1.乳酸菌和双歧杆菌的分离与鉴定

  我们从40份人类初乳样本中共分离出197个菌株,使用BLAST进行序列分析,并使用MEGA6.0通过系统进化树构建,进行物种鉴定。其中分离出的细菌属主要以葡萄球菌(26.9%)和链球菌(37.06%)为主,其他还包括肠球菌(2.54%)、乳杆菌(5.08%)、双歧杆菌(4.06%)、丙酸杆菌(1.02%)和放线菌等(1.52%;图1)。基于乳酸杆菌和双歧杆菌菌株的益生菌特性,我们筛选出来了两种耐酸和耐胆盐性质较好的菌株,根据它们的生理生化特性和16S rRNA序列分析结果,将两个菌株分别鉴定为乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9。
图1:初乳样本中各个菌属含量详情

  2.菌株的特征

  菌落形态学方面,在改良的MRS琼脂培养基上可以产生直径为1-2mm的凸圆形,乳白色菌落,具有完整的边缘和光滑的表明(图2A)。革兰氏染色显示为哑铃杆菌,两端规则,有许多明显的节点(图2B)。与此同时,鼠李糖乳杆菌Probio-M9在改良的MRS琼脂培养基上可以产生直径为1-2mm的乳白色或浅黄色圆形菌落,边缘规则,中心稍高,表明不透明(图3A)。革兰氏染色为短杆菌,呈链条状(图3B)。使用扫描电子显微镜可以评估两个菌株的形态(图2C和图3C)。

图2:乳双歧杆菌Probio-M8相关形态学特征
 
图3:鼠李糖乳杆菌Probio-M9相关形态学特征

  3.生理生化特征

  这两种菌株的生理生化特征如表1和表2所示。经过初步鉴定,乳双歧杆菌Probio-M8属于双歧杆菌属,可以在空气中、pH=4.5或6.5% NaCl中生长,但不能在pH=9.6的环境下生存;乳双歧杆菌Probio-M8还可以在10-42℃的环境下生长,并有效地使用葡萄糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖等,而对于木糖、核糖等利用效率较低。同样鼠李糖乳杆菌Probio-M9属于乳酸杆菌属,可以在空气中和pH=4.5的环境下生长,但是不能在pH=9.6或6.5% NaCl中生长;鼠李糖乳杆菌Probio-M9可以在42℃下生长,但不能在低温环境下生长,并可以有效利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、棉籽糖、木糖和其他碳水化合物等。

表1:乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9的生理生化特征


 
表2:乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9对碳水化合物的发酵

  对于两种菌株的耐酸耐肠液特性,我们评估了18株乳酸杆菌和双歧杆菌在pH=2.5下的耐酸性3小时,其中有8株表现出良好的耐受性。在pH=2.5的人造胃液和pH=8.0的人造肠液中对8株菌株进行了运输耐受性测试。表3显示了乳双歧杆菌BB-12、鼠李糖乳杆菌GG和植物乳杆菌P-8以及乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9等一系列菌株在人工胃液或肠液中存活情况的对比。发现乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9表现出高耐受性(存活率大于80%)。将乳双歧杆菌Probio-M8菌株暴露在pH=2.5的人工胃液3小时(存活率85.38%);在pH=8.0的人工肠液8小时(存活率97.25%),其存活率优于对照菌株乳双歧杆菌BB12。将鼠李糖乳杆菌Probio-M9菌株暴露在pH=2.5的人工胃液3小时(存活率83.72%);在pH=8.0的人工肠液8小时(存活率78.33%),其存活率优于对照菌株鼠李糖乳杆菌GG。在pH=2.5的人工胃液中暴露3小时,其他6个菌株的存活率在6.52%至38.06%之间,在pH=8.0的人工肠液中暴露8小时,其存活率在1%至31.59%之间。乳双歧杆菌GSL-1和植物乳杆菌LN-3-1对人工胃液的耐受性很小。

表3:乳双歧杆菌和乳酸菌在人工胃液、人工肠液中的存活率


 
  此外我们还对菌株胆汁盐的耐受性进行了评估(表4)。测量当每个菌株的光密度值OD(600nm)比0时的值大0.3个单位时的所需时间,也被称为滞后时间。我们发现在含0.3%胆汁盐的MRS肉汤培养基中,对照菌株和测试菌株的生长都受到了不同程度的抑制,均表现出良好的耐受性(滞后时间:Probio-M8为0.95小时、BB-12为1.98小时、Probio-M9为1.87小时、GG为2.10小时)。在0.3%胆汁盐的环境下,乳双歧杆菌Probio-M8显示出比其他两个对照菌株更强的耐受性,对胆汁盐环境的适应时间更短;而对于鼠李糖乳杆菌Probio-M9则显示出与乳双歧杆菌BB-12相似的胆汁盐耐受性,但比鼠李糖乳杆菌的耐受性要强。

表4:乳酸菌和乳双歧杆菌在0.3%胆汁盐环境下的耐受性


 
  对于生长速率方面,我们发现将乳双歧杆菌Probio-M8(1.725x107 CFU/mL)接种到改良的MRS培养基中,在37℃下连续培养30小时,在6小时进入对数生长,在18小时活菌数达到2.075x109 CFU/mL的峰值,之后略有下降至平稳状态(图4A)。将鼠李糖乳杆菌Probio-M9(1.555x107 CFU/mL)接种到改良的MRS培养基中,在3小时至18小时期间对数生长,在21小时活菌数达到2.976x109 CFU/mL的峰值,之后略有下降至平稳状态(图4B)。
图4:乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9的生长曲线

  试验结论

  母乳中蕴藏着众多有益菌群,通过分离筛选我们鉴定出了乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9。通过体外耐受人工胃液和人工肠液的一系列实验发现,乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9具有良好的耐酸和耐肠液特性,可以在消化道中存活。同时发现乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9对胆汁盐具有良好的耐受性,可以在适应的环境中迅速生长。




 
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