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具有降血压功效益生乳酸菌—Lactobacillus helveticus H9

时间:2017-07-13 16:13来源:本站原创 作者:李常坤 浏览次数:
       高血压是现代社会常见的疾病,影响着全球大约10-20%的成年人和40-50% 50岁以上的老年人。高血压的并发症有中风、冠心病、肾功能障碍、残疾和死亡等,时刻威胁着人类的健康。血管紧张素转换酶(Angiotensin-I-convertingen enzyme,ACE,EC 3.4.15.1) 是一种糖蛋白,普遍存在于哺乳动物组织中,对血压调节起着重要作用。ACE可通过肾素—血管紧张素系统(Rennin- Angiotensin System,RAS)、激肽释放酶—激肽系统(Kallikerin-Kinin System,KKS),对人体的血压、电解质和体液平衡、心血管系统发育和结构重塑都具有非常重要的作用。因此,ACE也是现代医学治疗和预防高血压最有效的靶点之一[2]

       瑞士乳杆菌H9(Lactobacillus helveticus H9、L. helveticus H9)是依托内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库中保藏的259株瑞士乳杆菌中选育的1株性能优良的益生乳酸菌。该菌株分离自西藏自治区那曲县罗马镇藏族牧民家庭自然发酵牦牛乳(kurut)样品。采用体外和体内相结合的方法对L. helveticus H9的降血压和益生功能进行了系统评价,并利用基因组学和蛋白质组技术对L. helveticus H9 的益生机制进行了深入研究。

       L. helveticus H9是目前国内抗高血压领域研究最为系统的益生乳酸菌,该菌株来源明确,遗传背景清楚,基础研究系统,其应用前景良好。

       1.      L. helveticus H9的分离与筛选 [1-3]
 
       L. helveticus H9是2008年分离自西藏自治区那曲县罗马镇藏族牧民家庭自然发酵的高ACE抑制活性酸牦牛奶(kurut)样品。通过生理生化实验和16S rRNA基因序列测定,鉴定为瑞士乳杆菌,其保藏号为IMAU60208、XZ16401。

  
    图1 研究人员采集L. helveticus H9的来源样品         图2 L. helveticus H9扫描电镜图片(×10000)              
 
       2.      L. helveticus H9的模拟胃肠液耐受性研究

       L. helveticus H9菌株在pH 2.5人工胃液中消化2 h后的存活率为98.39%,其后随消化时间延长存活率下降较快,消化3 h时存活率为76.53%,之后转入pH 8.0的人工肠液中消化8 h时,存活率上升至85.84%,表明该菌株具有较好的胃肠液耐受性。
图3  L. helveticus H9在模拟胃肠液中的耐受性情况    *表明与对照组相比具有显著差异(P<0.05),▲表明与pH2.5 3h存活率相比较具有显著差异(P<0.05)。
 
       3.      L. helveticus H9发酵特性研究[4-8]

       (1)牛乳、马乳和豆乳中发酵特性研究  
   
       L. helveticus
H9按不同接种量(2×106、5×106、1×107和2×107 cfu/mL)在牛乳、马乳和豆乳中的进行发酵,并测定储藏期间的pH值、滴定酸度、游离氨基氮含量、活菌数、ACE抑制率、VPP和IPP含量的变化。结果表明,该菌株发酵牛乳的ACE抑制率,VPP和IPP含量最高,将L. helveticus H9按5×106 cfu/mL接入11%的脱脂乳中,37 ℃发酵,pH值降至4.3时,其发酵乳ACE抑制活性、Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro含量分别为86.4±1.5 %、2.409±0.229 µM和1.612±0.114 µM。并且在储藏期间发酵乳的理化指标、微生物指标和ACE抑制率、VPP和IPP含量较稳定,表明该菌株发酵乳具有较好的储藏稳定性。

图4 不同接种量的L. helveticus H9发酵牛乳、马乳和豆乳的ACE活性
A:2×106cfu/mL;B:5×106cfu/mL;C:1×107cfu/mL;D:2×107cfu/mL.

       (2L. helveticus H9的复配菌株(或发酵剂)的选育

       课题组应用生产特性优良的17株菌株(或发酵剂)和Hansen商业化发酵剂作为实验菌株与L. helveticus H9进行了复配发酵,研究表明复配发酵乳的ACE抑制活性显著降低(P<0.05),并且VPP和IPP的含量也发生了不同程度的降低现象。但L. helveticus H9与L. lactis的复配发酵乳的ACE抑制活性、VPP和IPP含量明显高于与其他复配发酵乳。L. helveticus H9单菌发酵乳的粘度、脱水收缩性和活菌数分别为1768.7±206 cp、37.5±11.6 %和9.30±0.11 log cfu/mL,显示了较好的发酵特性。


表1  L. helveticus H9与不同菌种(或发酵剂)的复配发酵乳理化和微生物组成表
 
  L. helveticus H9 S. thermophilus L.lactis Yoghurt starter
复配菌种或发酵剂数量   7 7 4
ACEI(%) 86.4±1.5a 44.8±9.7b 58.4±11.0b 45.4±12.7b
VPP(µM) 2.409±0.229 a 2.031±0.870 ab 2.172±0.851ab 1.940±1.265b
IPP(µM) 1.612±0.114a 0.768±0.645b 1.209±0.659 ab 1.004±0.730b
FAN(mM) 5.552±0.193a 2.610±0.596c 3.391±0.236b 2.448±0.692c
TA(°T) 95.63±1.19a 82.27±5.94c 87.72±4.19bc 91.43±7.68ab
pH 4.34±0.03a 4.45±0.09a 4.41±0.06a 4.35±0.09a
粘度(cp) 1768.7±206.0a 1581.0±505.5a 1575.3±285.7a 1831.3±361.7a
脱水收缩(%) 37.5±11.6a 30.3±4.0ab 33.2±6.8ab 28.3±2.1b
活菌数
(log cfu/mL)
9.30±0.11a 7.79±0.28b 8.09±0.34b 8.29±0.48b
发酵时间 420 ±5a 447±38a 427±25a 398±45a
 
注:角标中含有相同字母的数据之间差异不显著(P>0.05)。
 

       (3)含益生菌L. helveticus H9发酵乳的研究
   
       将不同接种量的L. helveticus H9(1×106、2×106、5×106 和1×107 cfu/g)与商业酸奶发酵剂(YF-L904)进行复配发酵。通过对发酵乳的发酵特性(pH、滴定酸度、游离氨基氮和有机酸产量)、全质构、风味物质和感官指标的测定评价添加L. helveticus H9对发酵乳的影响。研究表明添加L. helveticus H9能显著增加发酵乳的ACE抑制活性,接种量为1×107 cfu/g时活性最高,并且对发酵乳的感官特性和贮藏稳定性无不利影响,该菌株适用于发酵乳生产。


图5 发酵乳全质构主成分分析
A:基于不同的H9接种量的发酵乳风味物质的主成分分析;B:基于不同时间点发酵乳风味物质的主成分分析(1D、7D、14D、21D和28D分别表示发酵乳贮藏1天、7天、14天、21天和28天)。

 
图6 发酵乳挥发性风味物质主成分分析(PCA)
A:基于不同的H9接种量的发酵挥发性风味物质的主成分分析;B:基于不同时间点发酵乳挥发性风味物质的主成分分析(1D、7D、14D、21D和28D分别表示发酵乳贮藏1天、7天、14天、21天和28天)。

       (4L. helveticus H9活性乳酸菌饮料的研究 [9]

       将L. helveticus H9应用于发酵褐色乳饮料中,制作成蛋白质含量不低于1%的活性乳酸菌褐色饮料。与对照组相比,L. helveticus H9将褐变乳发酵至200oT的时间缩短一半,发酵在7.5h后ACE抑制率达到了86.4±1.5 %,贮藏28天后其活菌数,VPP和IPP含量分别为(3.72±0.11)×108 cfu/mL,(1.17±0.02)μmol/L和(0.43±0.04)μmol/L。

       L. helveticus H9具有很好的活性乳酸菌饮料发酵特性和贮藏稳定性,该菌株适用于活性乳酸菌饮料的生产。
 
 图7 2种活性乳酸菌饮料的PCA得分图    “D”代表对照菌株,“23”代表L. helveticus H9。
 
 
具有降血压功效益生乳酸菌—Lactobacillus helveticus H9
图8 活性乳酸菌饮料的OPLS-DA得分图和S-plot图    D:对照菌株,23:L. helveticus H9。

       (5)基于代谢组学技术分析L. helveticus H9发酵乳动态变化

       利用超高液相色谱-时间飞行质谱联用仪(UPLC-Q-TOF-MS)从代谢组角度分析L. helveticus H9发酵脱脂乳48h过程中的代谢变化。通过多元统计分析可知,共1992种代谢物在发酵过程中被检测出来。VIP值>2的代谢物是潜在的对于发酵乳的风味、营养和功能性特性的体现发挥重要作用的物质。缬氨酸、苏氨酸、L-甲硫氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和亮氨酸是发酵过程中产生的主要氨基酸,其含量在发酵过程中显著变化。柠檬酸和尿酸是发酵过程中产生的主要的机酸。发现N-丙烯酰甘氨酸和烟酰胺-N-氧化物等中间代谢产物。发酵后期检出 Val-Leu、Lys-Gly、Ala-Glu、Asp-Ser、Leu-Pro和Val-Phe-Ala等寡肽。本研究解析了L. helveticus H9发酵乳动态变化,为该菌株的后期研究提供了基础。
 

       4.      L. helveticus H9的增殖培养基优化 [10]

       通过单因素实验、正交实验研究了不同碳源、氮源、碳氮比例、缓冲盐浓度、微量元素及其他生长因子对L. helveticus H9增殖培养的影响。并采用响应面法对优选的碳源、氮源和缓冲盐类的组成进行优化,得到增殖培养基:葡萄糖20 g/L,大豆蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaAC为7 g/L,K2HPO4为3 g/L,柠檬酸钠1 g/L,MgSO4·7H2O为200 mg/L、MnSO4·5H2O为81 mg/L、L-半胱氨酸0.25 g/L、吐温80为1 g/L。L. helveticus H9 在此增殖培养基中经37 ℃,10 h 培养活菌数可达到1.34×1010 mL-1,比在普通MRS中提高35倍,为产业化工艺的建立提供了重要研究基础。

      5.      L. helveticus H9发酵乳ACE抑制类型的研究[3]

       体外分别用胃蛋白酶(pH2.0, 4h)、胰蛋白酶(pH8.0, 4h)、胃蛋白酶(pH2.0, 4h)+胰蛋白酶(pH8.0, 4h)处理后,L. helveticus H9发酵乳的ACE抑制活性显著高于未处理的L. helveticus H9发酵乳。根据文献报道,L. helveticus H9发酵乳中ACE抑制肽属于前体药物类型或前体药物类型与真正抑制物类型的混合物。


图11 蛋白酶消化对L. helveticus H9发酵乳ACE抑制活性的影响
H9:未处理的L. helveticus H9发酵乳;P:胃蛋白酶消化的L. helveticus H9发酵乳;T:胰蛋白酶消化的L. helveticus H9发酵乳;P+T:先胃蛋白酶消化后再用胰蛋白酶消化的L. helveticus H9发酵乳。

       6.      L. helveticus H9发酵乳体内降血压效应研究[311]

       (1一次灌胃L. helveticus H9发酵乳对自发性高血压大鼠血压和心率的影响

       按15 mL/kg剂量给三组自发性高血压大鼠(SHR)分别灌服生理盐水(Control)、L. helveticus H9发酵乳(H9)和商业化酸奶(Yoghrut)后其24 h以内的收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和心率(HR)变化如图12所示。


图12  一次灌服对SHR的收缩压(SBP)舒张压(DBP)、心率(HR)的影响,*表示与同一时间点Control组相比具有显著差异(P<0.05)
 
       灌服L. helveticus H9发酵乳对SHR的SBP和DBP影响比商业化酸奶和生理盐水更明显,在灌胃后6-12 h内使SHR的SBP和DBP显著降低(P<0.05 ),其降幅为15-18 mmHg,最大降幅出现在灌服后8 h。并且灌服后24 h内,SHR的心率与对照组无显著差异(P>0.05),说明L. helveticus H9发酵乳对SHR的循环系统无不利影响。L. helveticus H9发酵乳一次灌服的降压效果与已报道的单一成分相比,起效时间较长、降血压幅度偏小,但降压有效时间较长,其原因很可能是L. helveticus H9发酵乳的ACE抑制活性肽前体物质经胃肠液中的消化过程,可释放ACE抑制肽,与上述“L. helveticus H9发酵乳ACE抑制类型的研究”结果一致。

       (2)多次灌胃L. helveticus H9发酵乳对大鼠血压的影响

       原发性高血压大鼠SHR:60只,雄性,7周龄,体重130±8 g,收缩压142±18 mmHg;随机分成4组,每组15只(对照组、H9组、Yoghurt组和Captopril组)。正常血压大鼠WKY:15只,雄性,7周龄,体重150.7±26.7 g,收缩压118±15 mmHg。实验室适应1周后,对5组大鼠实施每天灌胃:对照组(生理盐水、15 mL/kg BW)、H9组(L. helveticus H9发酵乳,15 mL/kg BW)、Yoghurt组(普通酸奶,15 mL/kg BW)、Captopril组(Captopril,20 mg/kg BW)和WKY组(L. helveticus H9发酵乳,15 mL/kg BW),并且根据体重变化每周调整剂量(灌胃体积)。
经灌服7周后各实验组的血压变化如图13所示。L. helveticus H9发酵乳降血压效应,虽显著低于Captopril(P<0.05),但明显高于普通酸奶,与对照组相比灌胃5周后SBP和DBP分别下降12 mmHg和10 mmHg,产生了显著效应(P<0.05),并且将此降压效应保持至本研究结束。



图13  多次给药对大鼠舒张压(DBP)的影响    *表示与同一时间点Control组相比具有显著差异(P<0.05)。

       (3左心室心肌病理学检测

       从图14的HE染色组织切片光镜检测中可见灌服L. helveticus H9发酵乳明显降低SHR的左心室心肌的病变状况,各实验组左心室心肌组织病理学观察特点如下:




图14 大鼠左心室组织HE染色病理切片(X200))    图14 大鼠肾脏组织HE染色病理切片(X200)

       SHR对照组(Control)心肌纤维形态多变,粗细不等,明显增生肥大且排列紊乱,有断裂的趋势(A);并且心肌细胞肥大,细胞核增大、偶见凋亡、坏死心肌细胞、胞浆染色加深(B);血管管壁较厚,周围部分呈玻璃样变性(C)。

       药物治疗组(Captopril)心肌纤维无明显肥大现象、心肌纤维间纤维化明显减轻(A);血管周围的胶原纤维减少(B)。

       L. helveticus H9发酵乳组(H9)心肌纤维略有肥大现象、心肌纤维间纤维化明显减轻(A);血管周围的胶原纤维减少(B)。

       普通酸奶组(Yoghrut)心肌细胞肥大,细胞核增大,纤维扭曲(A);血管壁增厚,无显著改善(B)。

       正常血压组(WKY)正常组心肌细胞排列整齐,细胞核大小均一,胞浆染色均匀。

       (4肾脏组织病理学检测

       从图14的HE染色肾脏组织切片光镜检测中可见灌服L. helveticus H9发酵乳明显降低SHR的肾脏组织的病变状况,其各实验组病理学观察特点如下:
 
       SHR对照组(Control)管壁明显增厚,管腔狭窄或闭塞。有的管壁发生变性、坏死,变为均质红色的半透明状(A);周边炎性细胞浸润,肾小球结构破坏明显,其囊壁与周围组织粘连,肾间质炎性细胞浸润(B)。

       药物治疗组(Captopril):血管壁变薄,病变程度减轻(A);肾小球结构形态正常(B)。

       L. helveticus H9发酵乳组(H9)肾小动脉出现病变血管的数量减少(A),病变程度减轻;SHR治疗组肾小球体积略有变大,结构较为完整(B)。

       普通酸奶组(Yoghrut)血管壁较厚,部分呈玻璃样变性,与模型组相比改善不明显(A);普通酸奶组肾小球体积变大,结构有破坏的趋势(B)。

       正常血压组(WKY)血管壁无增厚,未见病理变化(A);正常组肾小球结构完整,体积小,肾小管结构清晰,肾间质无炎性细胞浸润(B)

       (5左心室心肌基因表达模式的研究

      通过Affymetrix基因芯片共筛选出2247个差异表达基因(P<0.05),占大鼠基因组基因的7.2%。其中表达上调基因1099个,表达下调基因1148个。利用Heatmap对样品进行分级聚类后发现,实验组和对照组的3个样本被分别聚类在两个不同的分支,这说明灌胃益生菌确实对大鼠心脏的基因表达产生了较大的影响。对这些差异表达基因进行功能注释后发现有1404个基因具有确定的生物学功能。在这些功能基因中,我们发现了一些与高血压相关的基因,如eNOS (endothelial nitric oxide synthase),PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ),Ednra (endothelin type A receptor)。这些基因的差异表达很可能与H9的降血压效应相关。
图15 差显基因聚类图,横坐标表示样本名称,纵坐标表示探针号

       7.      L. helveticus H9 的基因组学研究[12-14]

       为了探寻L. helveticus H9发酵乳可以产生具有ACE抑制活性的物质的途径和机理,采用全基因组测序和蛋白质组学研究相结合的方法进行研究分析。

       L. helveticus H9染色体基因组为闭合环状分子,染色体长度分别为1,871,119bp,通过序列预测分析得到1815开放阅读框。通过COG功能分类和KEGG数据库对L. helveticus H9糖代谢、氨基酸代谢、蛋白水解系统、核酸代谢进行了分析,同时分析了菌株产胞外多糖的能力、CRISPR基因簇、插入序列等。比较基因组学研究表明细胞壁蛋白水解酶PrtH、胞内肽酶PepN、PepO和PepX是L. helveticus H9产ACE抑制肽的关键酶。



图16 L. helveticus H9基因组图谱

      8.      L. helveticus H9的蛋白质组学研究[15]

      构建了L. helveticus H9在乳中发酵不同生长时期的蛋白质组参考图谱,分析菌株在不同生长时期的蛋白质表达情况,重点对在后两个时期表达的乳酸菌蛋白水解系统的相关蛋白进行了分析。通过二维凝胶电泳图谱得到菌株在三个生长时期的蛋白斑点数分别为729(发酵初期)、1020(对数生长期)和925个(稳定期)。利用质谱成功鉴定了233个差异蛋白点,通过COG功能分类分析发现差异蛋白点主要是与翻译、核糖体结构和合成相关蛋白;核酸转运及代谢相关蛋白;碳水化合物转运及代谢相关蛋白;氨基酸转运及代谢相关蛋白等。其中与蛋白水解系统相关的蛋白PepN、PepE、PepO2以及OppC是在对数生长期和稳定期都表达的蛋白。该研究结果为我们从基因转录水平上解释L. helveticus H9在牛乳中的生长习性提供了一些线索,但仍然需要进一步的研究来阐明蛋白水解系统中相关基因的确切功能。



图17 L. helveticus H9不同生长阶段的2-DE图谱
 
       9.      瑞士乳杆菌的抗高血压活性及其种群结构的研究 [1617]

       采用多位点序列分型(Multi Locus Sequence Typing, MLST)(MLST)技术,以11个持家基因为靶点,完成了自然发酵乳制品中245株L. helveticus的遗传多样性分析,共鉴定出114个序列型。结果显示,不同分离株的序列型按照采样地以及样品来源呈明显规律性分布,表明自然生态环境在乳酸菌遗传异质性形成过程中扮演着非常重要的角色。同时对菌株发酵牛乳产ACE抑制肽特性和MLST分型结果进行关联分析,发现高产和不产VPP和IPP菌株各形成一个明晰的聚类,并基于这一发现建立的富产抑制ACE活性肽的瑞士乳杆菌的快速筛选技术。



图18 基于11个等位基因谱构建的来源于不同乳制品245株瑞士乳杆菌最小生成树图

 

图19 瑞士乳杆菌13个基因形成的NJ树与它们的发酵特性和抗高血压肽的关系
 
相关研究成果
1.       Airidengcaicike, Xia Chen, Xiaohua Du, Weihong Wang, Jiachao Zhang, Zhihong Sun, Wenjun Liu, Li Li, Tiansong Sun*, and Heping Zhang*. Isolation and Identification of Cultivable Lactic Acid Bacteria in Traditional Fermented Milk of Tibet in China. International Journal of Dairy Technology, 2010, 63(3):437-444.
2.       Tiansong Sun, Shuping Zhao, Haikuan Wang, Cike Cai, Yongfu Chen, and Heping Zhang*. ACE-inhibitory activity and γ-aminobutyric acid (GABA) content of naturally fermented milk from Tibet in China. Milchwissenschaft (Milk Science International), 2009, 64 (2):131-134.
3.       Yongfu Chen, Wenjun Liu, Jiangang Xue, Jie Yang, Xia Chen, Yuyu Shao, Lai-yu Kwok, Bilige Menghe, Lai Mang, and Heping Zhang*. Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of Lactobacillus helveticus strains from traditional fermented dairy foods and antihypertensive effect of fermented milk of strain H9. Journal of Dairy Science, 2014, 97(11):6680-6692.
4.       Wen Yi Zhang, Yong Fu Chen, Wen Jing Zhao, Lai Yu Kwok, and He Ping Zhang*. Gene expression of proteolytic system of Lactobacillus helveticus H9 during milk fermentation,Annals of Microbiology, 2015, 65 (2):1171-1175.
5.       Jicheng Wang, Changkun Li, Jiangang Xue, Jie Yang, Qing Zhang, Heping Zhang *, and Yongfu Chen*. Fermentation characteristics and angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity of stored yoghurt produced through fermentation by Lactobacillus helveticus isolate H9 in cows’ milk, soya milk and mares’ milk. Journal of Dairy Science. 98 :3655–3664.
6.       陈永福,李常坤,王记成. 益生菌Lactobacillus helveticus H9在脱脂乳中复配发酵特性研究. 中国乳品工业,2015,43(11):7-11.
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9.       Haoqian Wang, Yuzhu Ma, Rui Huo, Tingting Zhou, Jingna Zhao, Changkun Li, Heping Zhang*, and Yongfu Chen*. The study on the application of Lactobacillus helveticus in brown active milk beverages. 2017(未发表).
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12.    Yongfu Chen, Zhi Zhong, Jiangang Xu, Jie Yang, Qing Zhang, Jia Yue, and Heping Zhang*, DNA microarray analysis of the antihypertensive effect of milk fermented by Lactobacillus helveticus H9 on spontaneously hypertensive rats. Dairy Science & Technology, 2015, 95 (3): 321-330.
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14.    Wenjing Zhao†, Yongfu Chen† (并列第一作者), Zhihong Sun, Jicheng Wang, Zhemin Zhou, Tiansong Sun, Lei Wang, Wei Chen*, and Heping Zhang*, Complete Genome Sequence of the Lactobacillus helveticus H10, Journal of Bacteriology, 2011, 193(10):2666–2667.
15.    Yongfu Chen, Wenjing Zhao, Rina Wu, Zhihong Sun, Wenyi Zhang, Jicheng Wang, Billige Menghe, and Heping Zhang*. Proteome analysis of Lactobacillus helveticus H9 during growth in skim milk. Journal of Dairy Science, 2014, 97(12):7413-7425.
16.    Zhihong Sun, Wenjun Liu, Yuqin Song, Haiyan Xu, Jie Yu, Menghe Bilige, Heping Zhang, and Yongfu Chen*. Population structure of Lactobacillus helveticus isolates from naturally fermented dairy products and their relationships with antihypertensive peptide production, Journal of Dairy Science, 2015, 98(5):2962-2972.
17.    发明人:张和平、陈永福;申请日:2011年11月01日;发明名称:一种瑞士乳杆菌H9及其在制备发酵乳中的用途;申请号:201110338226.9.
18.    发明人:张和平、陈永福;申请日:2011年11月01日;发明名称:一种瑞士乳杆菌H9及其用途;申请号:201110337715.2.
19.    发明人:陈永福,张和平,孙志宏,李长坤;申请日:2016年10月13日;发明名称:富产抑制ACE活性肽的瑞士乳杆菌的快速筛选方法、实现所述方法的联合基因序列及其构建方法;申请号:201610895744.3.




 



 
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