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杨瑞馥:测序很强大,为何还要拓展微生物培养?

时间:2019-11-20 08:01来源:热心肠研究院 作者:肠道产业 浏览次数:
(ID:Gut_Industry),转载已获得授权。

    杨瑞馥,中国微生物学会副理事长、中国营养学会益生菌益生元和健康分会主任委员、2019 中国肠道大会益生菌和益生元大会主席。

    从事细菌菌基因组学、进化与致病机制和微生物法医学基础数据库的研究,以及检验新技术的研究。2004 年获国家自然科学基金重点项目资助;2005 年获得国家杰出青年科学基金。

    先后承担了国家 973计划、863计划、国家自然科学基金重点项目、重大传染病防治重大专项、军队科技攻关计划等几十项课题,获得国家科技进步二等奖 2 项,获军队科技进步一等奖 1 项,北京市科技进步一等奖 1 项,获中国发明专利 1 项、实用新型专利 4 项,发表 SCI 学术论文 100 余篇,累计影响因子超过 300,累计 H因子 22,单篇最高影响因子为 53.5。2014 年 8 月 28 日,中央军委主席习近平签署通令,给予军事医学科学院研究员杨瑞馥记三等功。

(以下是图文实录)

    我非常感谢热心肠先生的邀请,来到 “肠 · 道” 这个舞台上,给大家分享一下有关培养组学的过去、现状和未来。


 
    我来自军事科学院军事医学研究院,主要工作是从事病原学研究,我们实验室主要做鼠疫菌。

    关于鼠疫,我们都知道,历史上有三次大流行。我们实验室和德国科学家合作,首次通过基因组学的办法来揭示了鼠疫菌在过去三次大流行当中的传播规律。同时呢,我们也揭示了鼠疫菌在自然进化过程当中它的可变分子钟的新遗传规律。

    在上个世纪末的时候,我们都知道,以美国为首的西方国家对伊拉克发动了海湾战争,其实主要是怀疑伊拉克有生物武器。所以这也给我一个机会到伊拉克参加联合国的活动,来调查其生物武器的情况。

    我们也知道,本世纪初在本 · 拉登给美国制造了 911事件的同时,又发生了炭疽的白色粉末的恐怖事件。那么就带来一个新的问题,谁放的这个病原菌?这病原菌哪来的?也就是说病原菌要溯源,因此诞生一个新的学科叫微生物法医学。

    我们必须用微生物的 DNA 指纹来识别微生物的来源,因为我们都知道,细菌的基因特征是千差万别的。像我们最擅长的鼠疫菌的基因组是非常保守的。

    还有一类微生物呢,是副溶血弧菌,大家可以看到,这个幻灯片上像一个大车轮一样,根本没有这种 Population Structure(通用结构)。像这种结构的微生物,它和鼠疫菌溯源的方式肯定不一样。

    所以通过对副溶血弧菌的研究我们就发现,基因之间的上位相互作用决定着它的生态型,也决定着它的共进化规律。所以我们用这些可以实现副溶血弧菌的溯源。

    在 2011 年,又发生了一个影响比较大的食物中毒事件。这个事件源于德国,导致这次事件的这个菌株是一个新型的大肠杆菌——O104H4 菌株。当时我们有幸在华大基因和德国科学家合作,把这个菌株进行了全基因组的测序。

    我们不是去自己分析,而是测序之后,第一时间把结果公布在网上,世界各国感兴趣的科学家可以随意下载进行分析。但我们要求他们把分析结果再传到网上和世界各国的科学家来共享。所以我们做了一套 Open Source Genomics Analysis(开源基因组分析)这么一个方法。

    我们这个序列上传到网上之后不到一个月,我们的基因组就被下载了大概 15000 次,各国科学家上传的有价值的报告有六十几份。

    我们就依据这些报告写成了一篇文章,然后被 New England Journal Of Medicine (《新英格兰医学》杂志)接受并发表了。

    在发表之后,英国皇家学会出了一个报告,这个报告以我们测的基因组图为封面。报告说,科学应该是一个开放的事业,不应该是自己做,这样就会限制我们的思维。


 
    在做基因组溯源的同时,我们还做另外一项工作:在一个传染病或者是一个生物恐怖事件发生的时候,人们能够第一时间知道是什么微生物造成的。为了达成这个目标,就需要有现场快速检测技术,所以我们实验室发展了基于上转发光的现场快速检测技术。

    这种检测技术是一个特殊的稀土纳米颗粒在低能量激光激发下发射出来的光,在颗粒内部有个能量跃迁,它发出来的光能量变强了,所以我们称之为上转发光现象。这种现象在自然界当中是不存在的。

    我们利用这个颗粒去检测微生物,就可以实现零本底的检测,而灵敏度也会大大增加。这个技术是我们在国际上首次实现产业化,到现在还是独家。

    同时我们实验室还做着肠道微生物培养组的工作。

    在这,大家可能从我介绍自己的背景中会提出疑问:一个做病原菌研究的人,为什么要跨界到肠道微生物里边来研究?书归正传,回到微生物组的话题上。


 
    我们都知道,地球上存在着很多微生物,大概有 5×1030 这么多。其实我们现在分离得到的细菌只有 15000 种左右,按每一种有 100 株细菌计算的话,那么我们拿到的活的细菌也就 150 万株。

    我们的肠道里边大概有 10×1014个细菌,我们现在从肠道里分离出来的细菌种类只有 1500 多种。也按每一种有 100 株算的话,那也就 15 万株活的细菌存在。

    从上下这两组数据,大家可以看到,我们要培养这些微生物,还任重道远,还有很多路要走。


    谈到微生物的培养,我们回顾一下过去做出贡献的这些伟大科学家。

    首先,列文虎克,我们都知道,他发明了显微镜,首先看到了微生物。

    科赫发明了固体培养基,首先分离到了微生物,分离到了细菌,像炭疽、霍乱这些细菌都是科赫分离出来的。同时他也提出来了怎么判定一个微生物是不是致病菌的科赫氏三原则或者叫四原则。

    当然还有巴斯德,他发现了食物腐败的原因也是细菌导致的。

    这三位科学家的贡献就给微生物发展的第一个黄金时期奠定了良好的基础。


    在他们的基础之上,英国科学家、澳大利亚科学家、美国还有其他国家的科学家,又在其他细菌的分离培养当中做出了巨大贡献。

    这里面包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、志贺氏菌、伊尔森氏鼠疫细菌还有一些其他的细菌,包括我们肠道的益生菌——保加利亚乳杆菌。

    在这里边值得一提的是马歇尔教授——就是澳大利亚一个科学家,他建立了幽门螺杆菌和胃炎之间的直接联系,因此获得了诺贝尔奖。

    在他之前,其实在这幻灯片中我想给大家显示是我们国家的科学家——汤飞凡教授,他分离了沙眼衣原体,而且他也把这个病原体抹到自己眼睛上,证实了这个病原体就是沙眼的罪魁祸首。如果他不遭受困境,要活到现在,我相信他一定也能获得诺贝尔奖。

    那么最后这位女士呢,就是分离出来 AKK 菌,肠道里边非常著名的一个细菌。

    在第一个黄金时期我们做了大量的微生物分离培养以及大量的疾病和病人之间关系的揭示,当然也发现了益生菌。


    随着我们科学技术的进步,我们认识到微生物除了细菌之外还有病毒。最早发现的病毒就是噬菌体,而噬菌体和细菌的相互作用就是上图前两位科学家揭示的。

    第三位科学家兰德伯格发现了我们的染色体或者遗传物质可以通过质粒介导的转化,噬菌体介导的转导,发现了这些新的遗传规律。

    当然最后两位科学家大家都熟悉,沃森和克里克揭示了 DNA 的双螺旋结构。

    由于他们五位的工作,使微生物学研究进入了第二个黄金时期。也就是这个黄金时期驱使着大量的微生物学家去做分子的研究,而做微生物本身的研究相对减少了。所以在第二个黄金时期我们基本上把微生物学就和分子生物学画上了等号。


 
    在近十年来,微生物组学的发展使我们把微生物组和人体的疾病与健康建立了密切的联系,这也推动着我们微生物组学的研究进入了第三个黄金时期。

    在这个时期,相关的研究技术出现很多,其中最主要的是这些组学技术,包括 16sRNA 基因的测序,宏基因组的、宏转录组的、或者宏蛋白质组的等等这些组学的分析。这些组学技术还是一种间接了解微生物组的方法。


    但是我作为一个微生物学家,最希望了解微生物与疾病或者与健康之间的关系,还要拿到这些实实在在的微生物活体。所以现在科学又发展了一系列培养组学的技术。

    培养组学技术的发展,我前面说,它有现实需求。我们微生物组的研究需要培养组学技术,需要把那些微生物培养出来,同时还有一些技术发展的支撑。

    现在质谱技术的发展使我们能够鉴定细菌;高通量的技术与测序技术能够使我们高通量地分析那些质谱鉴定不出来的细菌。

    这两个技术平台的支撑就决定着我们可以大量地分离细菌,然后进行高通量的测序,给我们的研究奠定了很好的基础。


    如果我们把这些很复杂的肠道微生物放在一起来分析的话,这里边就存在着有革兰氏阳性的,有阴性的;有的长得快,有的长得慢;有的需要营养不那么丰富,有的需要营养特别苛刻;有的需要高温下培养,有的需要低温下培养;有的厌氧,有的需氧。

    在这么复杂的环境下,我们需要有不同的应对策略来分析,分离这些微生物。


    在这个领域的开拓者是法国马赛大学的 Raolut 教授。

    他们首先做的培养组学,开始就采用了不同的培养基,不同的培养条件,加不同的处理方法,有 200 多个条件来分离培养。后来他们又优化成了 70 种条件,到现在他们又进一步优化成 18 种条件来做肠道微生物的分离培养。

    从这张图上我们可以看到,目前从肠道里分离出来的细菌总数量大概 1500 多种,他们大概就分离出了 77% 的菌种。我们也看到,一个工作如果我们坚持做下来,对这个领域会有巨大的贡献。


    这是他们优化出来的 18 种分离培养的条件,因为时间问题,我就不再一一解释这些条件,但大家可以从这些条件略微综合一下。


    我们看到有三个关键因素:一个就是血瓶的预培养,可以增加 56%的新种;另外一个就是在培养液里边加瘤胃液,加上这个液体之后,可以使我们的新种数多获得 40%;当然还可以加绵羊血,使新种的数多获得 25%。

    如果注意到这三个因素,那会大大提高我们分离肠道微生物新种的机会。


    但是还有些微生物是极其难分离培养的。

    像这张幻灯片给大家讲到的 SFB 这个细菌,这个细菌其实在我们肠道里非常重要,和我们免疫系统的发育有直接的联系,尤其是 Th17 的发育和成熟离不开这个细菌。但是这个细菌到现在为止,从人体里边还没有分离到。

    这篇文章写的是,从小鼠的肠道里边,用细胞培养的办法把这个细菌给分离出来了,然后他研究了这个细菌和小鼠的相互作用。这篇文章就发到 Nature 上。

    大家也可以看到我们的培养组学,如果我们分离到一个很重要的微生物,而且我们在分离培养技术上有大大的改进,能够研究这个微生物和它所在的宿主之间的相互作用,那也是能够发很好的文章。

    当然我们研究的目的不是为了发文章,是为了推动这个领域的进步。


    同时给大家举的另外一个例子,就是我们拿到微生物之后怎么办呢?

    像 AKK 这个细菌在 2004 年就已经分离出来了,后来通过测序从肠道里边也测到了这个细菌,发现它所占的比例很高。再后来又把这个细菌的全基因组给测序了。

    但是直到 2012 年、2013 年,我们才把这个细菌和炎症与肥胖关联起来,这只是一个关联,还没有一个直接证据。到现在为止,发现这个细菌已经十多年了,还没转化成一个产品。是治疗的靶标?还是诊断的方法?还没往临床上去转化。

    所以我们可以看到,即使拿到了微生物,这个转化也是非常难的。

    上面这张图给大家显示的是 Nature 的一篇综述,专门讨论转化医学的难度。这个告诉大家呢,研究、发论文相对比较简单,真正转化成产品还是非常难的。

    这个综述总结的是肿瘤的标志物,当时他们统计了 15 万种标志物的报道,但是真正转化到临床只有不到一百种。这个转化应该是大部分摔死在了“死亡之谷”。


    我们培养组的转化这么难,就没有未来了吗?其实它是有光明的前途的。

    首先,我们拿到了这些微生物,建立了实物库,这个库是我们研究微生物组的物质基础,没有这些微生物,我们就缺乏了研究的根基。

    同时我们不会每一种只拿一株菌,肯定要拿多株细菌。这也是赵立平老师一直在提倡大家,研究肠道微生物和健康与疾病的关系,一定要把菌种的研究推到株的水平。

    假如我们没有拿到这些微生物,尽管生物信息学目前发展了一些方法,能分析到菌株的水平,但分析到的菌株种类和数量还是比较有限;目前我们拿到了这些微生物,就一定要尽可能的把它们分析到菌株的水平,我后面有张幻灯片,会给大家解释,这件事有多重要。

    目前其实生物信息学中不论是基于 16sRNA 分析,或者基于全基因组的分析,都还有各种各样的问题。但是我们需要对一个实物库实实在在的基因库作对照,去优化我们的生物信息学流程。

    第二个光明前途就是拿到了实物,我们就有转化的基础了。我们有了这些活菌库,就等于就有了活菌药物库。

    因为过去我们研究药物,一般都是用一个化合物库。其实这个活菌库和化合物库是等同的,将来肠道微生物的研究一定会推动活菌药物的研究,这是一个新的趋势。

    同时,其实 FMT(粪菌移植)现在转化就是一个黑洞式的转化。我们筛选到健康的个体,按现在的标准给病人移植了,病人好了。但是具体怎么好的,哪些微生物起作用,以及微生物之间怎么起作用,我们不知道,所以我称之为黑洞式转化。

    将来有了这个微生物库之后,我们希望通过测定肠道微生物的组成、比例和它的种类,然后我们可以看到,它少哪些微生物,缺哪一株,我们人为地给它合成一个菌群,去移植。那这才是真正的个体化精准医疗。

    第三个方向,我们还希望在培养组学的方向不断优化我们的技术。不论是培养基、培养条件,还是我们大开脑洞去想一些其它的添加剂,来促使肠道微生物组的分离培养,获得更多的菌种,这是技术方面的优化。


    最后,给大家介绍一点我们在肠道微生物领域里边的工作。

    我们一直在做肠道微生物和免疫之间的关系的研究,尤其 Th17 细胞和肠道微生物之间的关系的研究。我们也在做 IBD 与大肠癌和微生物组的关系的研究。我们主要是做培养组学。

    旁边这个树给大家显示的是,我们从结肠癌术后癌组织表面分离的大肠杆菌。当然我们分离了很多的细菌,拿大肠杆菌为例。一个病人我能分 100多株大肠杆菌出来,这 100 株大肠杆菌,大家从这张树上看,都不一样,没有两株是一样的。

    我们还把癌旁边组织的大肠杆菌也分离出来了,然后进行比较分析。我们希望通过其它表型的关联项,促进炎症反应情况等等,去做一些关联,去找到真正菌株水平对致病之间的差异。所以为什么做培养组学,原因就是推动到菌株的水平。

    同时呢,我们也在做培养组学技术的开发,也做一些基于培养组学、实物库测序后的基因组数据库,来优化生物信息流程。

    当然我们也在做一些关于益生菌和益生元对健康的影响。除了微生物组以外,还测了一些人体的其他指标。

    当然更重要的一个领域我前面提到过,就是活菌药物。

    我们现在的肠道微生物研究还没有标准,如果我们找到一个益生菌,所谓的益生菌,就是列为我们国家的益生菌菌种目录里边的细菌,我们可以把它开发成食物级别的细菌,供大家来吃,来服用,来改善健康。

    但是如果这个菌,既非常有益,又不在这个目录里怎么办?我们现在的规定只能按照国家一类新药去发展,所以这就是活菌药物发展的现在的途径。

    当然希望将来有一天我们会推动一个政策的改动,就是说把现在发现的新的有益生作用的肠道细菌也纳到新的食品资源目录里面,作为益生菌来开发,那就使这些药物的开发相对就比较简单一些。所以我们希望来推动这个技术的进步。

    好,那谢谢大家!

(全文结束)



 
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