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张和平:肠道菌群宏基因组研究产品 落地回馈奶牛养殖

时间:2016-10-31 17:59来源:未知 作者:bio149 浏览次数:
    内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室主任  博士生导师 张和平教授 在第四届中国生物饲料科技大会上的主题报告摘要。
 

    抗生素滥用已成为世界性难题,每年由于抗生素滥用给人类带来数十亿美元的损失,因此世界各国相继出台法律法规禁止抗生素滥用,这对于畜牧人来说既是机遇也是挑战。牛场管理、病原菌感染和奶牛体质等因素都可能造成奶牛乳房炎(体温升高,乳房红肿痛,体细胞数(SCC)升高,牛乳呈棕黄色,脓浆),导致巨额经济损失、增加细菌耐药性、抗性基因污染,最终威胁食品安全(见图1)。因此对益生乳酸菌在奶牛养殖中应用研究具有重要意义。
 

    1、健康奶牛与乳房炎奶牛肠道菌群定量与宏基因组研究

    1.1研究方法

    (1)利用实时荧光定量PCR技术,对36头健康奶牛(SCC<30万/mL)与36头患乳房炎奶牛SCC>100万/mL)的肠道菌群与乳腺菌群中细菌和真菌总量,及大肠杆菌和葡萄球菌等常见的乳房炎致病菌属,双歧杆菌与乳杆菌属为代表的肠道有益菌属进行定量分析,探究两组奶牛各种属数量上的差异。

    (2)选取健康组(CH,20头 ,SCC< 30万/mL),乳房炎组(CM,20头, SCC>100万/mL) ,采用二代、三代测序技术相结合的方法从宏基因组角度完成了40头奶牛粪便中微生物多样性和Metagenome分析,探究揭示乳腺炎与奶牛肠道微生物及功能基因的关系。

    1.2 结果
 
    (1)链球菌属Streptococcus、肠球菌属Enterococcus、大肠杆菌E. coli数量在乳房炎组较高,而乳酸乳球菌Lactococcuslactis、乳杆菌属L actobacillus、双歧杆菌属Bifidobacterium等有益菌的数量在健康组中较高;布氏乳杆菌L.buchneri、干酪乳杆菌L.casei、清酒乳杆菌L.sakei、唾液乳杆菌L.salivarius等12种乳杆菌种在健康奶牛肠道以及乳腺中的含量较高;肠道中乳杆菌属Lactobacillus,双歧杆菌属Bifidobacterium与乳头中的葡萄球菌属Staphylococcus、肠球菌属Enterococcus、大肠杆菌E.coli以及乳体细胞数均呈负相关(见表1)。
 
表1乳杆菌属和双歧杆菌属与乳体细胞和乳腺炎病原体的相关性

    (2)基于三代测序技术完成健康组、乳房炎患病组共40头奶牛肠道微生物组成分析,共识别出319个细菌种,平均相对含量在0.1%以上的菌种共有28个。其中蝙蝠弧菌属Vampirovibrio在乳房炎组含量高,该菌可引起轻度腹泻与红细胞溶血。真杆菌属Eubacterium,颤螺旋菌属Oscillibacter等产酸菌在健康组含量较高。α多样性分析结果与Mann-Whitney检验发现,健康组微生物物种丰度和多样性显著高于乳房炎组,乳房炎组奶牛肠道微生物结构趋于简单化。

    2、无菌小鼠模型进行健康奶牛与乳房炎奶牛肠道菌群移植实验

    2.1动物实验设计 

    在奶牛肠道菌群结构与功能研究基础上,进一步验证肠道菌群与乳房炎发病的关联。以4月龄无菌C57BL/6J孕鼠为动物模型进行奶牛粪菌移植实验。采集乳房炎奶牛粪便12份,健康奶牛粪便12份,两组奶牛粪便混合后进行移植实验。孕鼠产前3天进行相应的实验干预,直至25天实验结束 。实验设计流程见图2。
 
 

    2.2 结果

    (1)移植乳房炎奶牛粪菌的M组小鼠乳头明显观察到红肿现象,有炎症发生。移植健康奶牛粪菌的H组小鼠乳头外观与移植乳房炎奶牛粪菌+益生菌的Z组小鼠乳头外观没有红肿现象。H组腺泡清晰整齐,M组腺泡损伤,Z组腺泡较M组完整。M组乳腺组织IL-6,MPO,TNF-a含量均显著高于H组,而Z组的IL-6与TNF-a含量显著高于M组,结果表明益生菌干预提高了机体免疫应答强度,尤其显著提高IL-6的含量,从而对乳腺炎症起到防治作用。

    (2)结肠IL-1β,空肠中IL-6和TNF-a的含量在三组小鼠中均存在显著差异,尤其IL-1β的含量为 M组>Z组>H组。这表明乳房炎奶牛肠道菌群中致病菌的含量较高,并对肠道产生较强的刺激,引起机体产生了强烈的免疫应答反应,而益生菌的摄入可以缓解该症状。

    (3)血清中IFN-y,IL-4,L-10,IL-17,LZM(溶菌酶),内毒素含量分析结果显示,含量均为M组>Z组>H组,可推测内毒素经肠道渗透进入血液引起内毒素血症,进而导致炎症发生。

    3、小鼠与奶牛肠道菌群宏基因组学分析

    (1)通过对小鼠与奶牛肠道菌群宏基因组学分析表明,H组小鼠与健康奶牛乳杆菌的相对含量较高,而M组与Z组小鼠及乳房炎奶牛拟杆菌相对含量较高。

    (2)香农指数、辛普森指数、chao1指数均体现出健康奶牛与H组小鼠肠道菌群α多样性较高。

    (3)通过OTU水平的PCoA与属水平PCA分析,Meta-Storms相似性距离统计分析后判定β多样性具有显著性差别,健康奶牛菌群移与H组小鼠菌群结构更为相似,证明健康奶牛肠道菌群更为稳定。

    (4)H组小鼠肠道中发酵产生乙酸、丁酸与琥珀酸的粪球菌属C oprococcus、瘤胃球菌属Ruminococcus、Anaerostipes以及乳杆菌属Lactobacillus相对含量较高的,而拟杆菌属Bacteroides与梭菌属Clostridium的含量低于乳房炎奶牛组与移植其粪便的两组小鼠,产酸菌属维持肠道低pH的内环境,与乳杆菌属Lactobacillus互利共生,酸性环境抑制了致病菌的繁殖。

   4、结论

    乳房炎奶牛与健康奶牛肠道菌群结构与功能均有显著差异。(1)健康奶牛肠道菌群结构稳定,对环境外压的抵抗力强;(2)产酸菌与乳杆菌丰度较高,可降低肠道内的PH值,抑制致病菌增殖;(3)乙酸、丁酸为机体供能的同时还可修复肠膜损伤;(4)移植健康奶牛粪便小鼠肠道菌群能量代谢系统更为活跃,证明健康的肠道菌群可加强宿主与外界的物质能量交换,增强宿主体质,维持宿主健康稳态,进而预防乳房炎的发生。总之,益生菌可增强肠道菌群的活力与能量代谢系统,提高肠道菌群的功能基因多样性,提高产酸菌丰度,增强机体免疫应答,维护肠黏膜屏障作用,对乳房炎具有良好的防治效果。
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